잠금 핵산

잠금 핵산은 2'-O, 4'-C 메틸렌 다리(methylene bridge)가 함유된 새로운 유형의 핵산 유사체입니다(그림 1). 3'-엔도 구조는 리보푸라노스 고리의 유연성을 제한하고 구조를 단단한 두 고리식 화합물로 고정시킵니다. 이에 따라 분석 성능이 향상되고 적용 범위가 확장됩니다. 

그림 1. 잠금 핵산과 토종 DNA 모노머의 구조입니다.

• 장점
• 응용분야
• 참조자료

PCR 프라이머의 잠금 핵산, qPCR 프로브 및 기타 유형의 올리고뉴클레오티드는 물과 표준 버퍼에 용해되며 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing) 규칙을 따릅니다.¹

특장점

올리고뉴클레오티드와 결합하는 경우 잠금 핵산은 토종 DNA 염기와 비교하여 다음과 같은 몇 가지 이점을 제공합니다.

• 열 안정성 및 교배 특이성 증가
• 유전자 정량화 및 대립형질 식별 정확도 향상
• 문제성 표적 염기서열에 대한 보다 쉽고 유연한 설계

열 안정성 및 교배 특이성 증가

잠금 핵산을 올리고뉴클레오티드에 결합하면 이중 열 안정성이 증가하고² 표적 염기서열에 대한 올리고뉴클레오티드 교배 특이성이 향상됩니다.³ qPCR의 경우 이를 통해 가결합으로 인한 배경 형광(background fluorescence)이 감소하여 신호 대 잡음 비율이 증가합니다. 또한 표적으로의 PCR 프라이머 또는 qPCR 프로브 교배가 향상되면, 염 배지 조건에서 잠금 핵산 모노머를 치환할 경우 토종 DNA 올리고뉴클레오티드⁴에 비해 용해 온도(T_m)가 최대 8°C까지 상승할 수 있습니다(표 1). 이러한 교배가 증가하면 분석 조건의 범위가 상당히 확장되고 더욱 성공적인 다중화를 이룰 수 있습니다.⁵

표 1 올리고뉴클레오티드에서 잠금 핵산 염기의 수가 증가하면 T_m이 상승합니다.

염기서열	고정된 염기	Tm*	ΔTm	ΔTm/Locked Base
GTGATATGC	0	29 °C		—
GTGATATGC	3	44 °C	15 °C	+5 °C
GTGATATGC	9	64 °C	35 °C	+3.9 °C

*올리고뉴클레오티드 및 보완적 염기서열 사이의 이중 T_m입니다.
염기서열의 굵은 글씨체는 잠금 핵산 염기를 나타냅니다.

유전자 정량화 및 대립형질 식별 정확도 향상

SNP를 통해 대립형질을 식별할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 기능이 잠금 핵산 염기의 결합^6-8을 통해 크게 향상됩니다(그림 2). 단일 염기 불일치가 존재하면 잠금 핵산 올리고뉴클레오티드와 그 표적 사이의 이중결합 형성 면에서 토종 DNA 올리고뉴클레오티드에 비해 상당히 큰 불안정한 결과를 가져옵니다. 잠금 핵산 염기를 포함하는 짧은 올리고뉴클레오티드는 길이가 더 긴 토종 DNA 올리고뉴클레오티드와 같은 온도에서 사용될 수 있습니다.

그림 2. SNP 유전자형 분석9에서 DNA 이중표지 프로브보다 잠금 핵산 이중표지 프로브를 더 잘 식별할 수 있습니다. 분홍색) 잠금 핵산 돌연변이 프로브(3개의 잠금 핵산 염기를 가진 16 mer)를 이용한 돌연변이 DNA 분석입니다. 녹색) 토종 DNA 돌연변이 프로브(25 mer)를 이용한 돌연변이 DNA 분석입니다. 적색) 토종 DNA 돌연변이 프로브(25 mer)를 이용한 야생형 DNA입니다. 자주색) 잠금 핵산 돌연변이 프로브(3개의 잠금 핵산 염기를 가진 16 mer)를 이용한 야생형 DNA입니다.

문제성 표적 염기서열에 대한 보다 쉽고 유연한 설계

T_m 상승을 동반한 잠금 핵산의 교배 특성이 향상되었으므로 잠금 핵산 올리고뉴클레오티드를 더 짧은 길이로 합성할 수 있습니다. 이렇게 되면 토종 DNA 올리고뉴클레오티드에서 발생하는 특정한 설계상의 한계를 극복할 수 있습니다. 구체적으로 설명하면 잠금 핵산 올리고뉴클레오티드는 AT 또는 GC가 풍부한 영역과 같이 전통적으로 문제가 되는 표적 염기서열의 문제를 해결하도록 설계할 수 있습니다. 예를 들어 AT가 풍부한 토종 DNA 올리고뉴클레오티드는 앰플리콘 설계 지침을 만족하기 위해 30개 염기 길이 이상(간혹 40개 이상)이 되어야 하지만 성능은 좋지 않을 수 있습니다. 그러나 잠금 핵산 올리고뉴클레오티드를 사용하면 잠금 핵산의 선택적 배치를 통해 13-20개의 염기 길이에서도 좋은 성능을 내는 매우 명확하고 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드를 최적으로 설계할 수 있습니다. 또한 상대적으로 안정적인 G:T 불일치와 같은 까다로운 SNP를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 설계가 잠금 핵산에 의해 크게 향상될 수 있습니다. 

또 다른 이점

잠금 핵산 PCR 프라이머 및 qPCR 프로브는 모든 실시간 유전자 증폭기 및 엔드 포인트 분석 검출기와 호환됩니다. 따라서 호환용 특수 기기가 필요하지 않습니다.

응용분야

잠금 핵산은 다음을 포함한 qPCR 검출 화학 분야에 모두 사용할 수 있습니다.

• SYBR^® 그린 프라이머
• 이중표지 프로브
• 분자 비콘
• LightCycler^® 프로브
• Scorpions^® 프로브

다음과 같은 분야에 유용합니다.

• SNP 검출
• 대립형질 식별
• 병원체 검출
• 다중화
• 바이러스양 정량화
• 유전자 발현 분석
• 유전자 복제 결정

다음 염기서열에도 사용할 수 있습니다.

• 안티센스 올리고뉴클레오티드
• 유인 올리고뉴클레오티드
• 포획용 프로브
• 앱타머
• 리보자임

참고문헌

1. Egli M, Teplova M, Minasov G, Kumar R, Wengel J. 2001. X-ray crystal structure of a locked nucleic acid (LNA) duplex composed of a palindromic 10-mer DNA strand containing one LNA thymine monomer. Chem. Commun..(7):651-652. https://doi.org/10.1039/b009447l

2. Braasch DA, Jensen S, Liu Y, Kaur K, Arar K, White MA, Corey DR. 2003. RNA Interference in Mammalian Cells by Chemically-Modified RNA?. Biochemistry. 42(26):7967-7975. https://doi.org/10.1021/bi0343774

3. Latorra D, Arar K, Michael Hurley J. 2003. Design considerations and effects of LNA in PCR primers. Molecular and Cellular Probes. 17(5):253-259. https://doi.org/10.1016/s0890-8508(03)00062-8

4. CHRISTENSEN U, JACOBSEN N, RAJWANSHI VK, WENGEL J, KOCH T. 2001. Stopped-flow kinetics of locked nucleic acid (LNA)?oligonucleotide duplex formation: studies of LNA?DNA and DNA?DNA interactions. 354(3):481-484. https://doi.org/10.1042/bj3540481

5. Latorra D, Hopkins D, Campbell K, Hurley JM. 2003. Multiplex Allele-Specific PCR with Optimized Locked Nucleic Acid Primers. BioTechniques. 34(6):1150-1158. https://doi.org/10.2144/03346bm06

6. Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM. 2003. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3? locked nucleic acid (LNA) primers. Hum. Mutat.. 22(1):79-85. https://doi.org/10.1002/humu.10228

7. Mouritzen P, Nielsen AT, Pfundheller HM, Choleva Y, Kongsbak L, Møller S. 2003. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA?). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3(1):27-38. https://doi.org/10.1586/14737159.3.1.27

8. Simeonov A. 2002. Single nucleotide polymorphism genotyping using short, fluorescently labeled locked nucleic acid (LNA) probes and fluorescence polarization detection. 30(17):91e-91. https://doi.org/10.1093/nar/gnf090

9. Ugozzoli LA, Latorra D, Pucket R, Arar K, Hamby K. 2004. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324(1):143-152. https://doi.org/10.1016/j.ab.2003.09.003