pGEX Vectors
Các protein gắn thẻ GST được xây dựng bằng cách chèn một gen hoặc đoạn gen vào MCS của một trong 13 vectơ pGEX. Biểu hiện nằm dưới sự kiểm soát của promoter tac, được gây ra bởi isopropyl β-D-thiogalactoside tương tự lactose (IPTG). Tất cả các vectơ pGEX cũng được thiết kế với một gen lacIq bên trong. Sản phẩm gen lacIq là một protein ức chế liên kết với vùng vận hành của promoter tac, ngăn chặn biểu hiện cho đến khi cảm ứng bởi IPTG, do đó duy trì kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện của hạt dao.
Chín trong số các vectơ có MCS mở rộng chứa sáu vị trí hạn chế. MCS mở rộng tạo điều kiện cho việc nhân bản đơn hướng các hạt dao cDNA thu được từ các thư viện được xây dựng bằng nhiều vectơ lambda có sẵn. PGEX-6P-1, pGEX-6P-2, và pGEX-6P-3 mỗi mã hóa trình tự nhận dạng cho sự phân tách riêng của địa điểm bởi PreScission protease giữa miền GST và MCS. PGEX-4T-1, pGEX-4T-2, và pGEX-4T-3 có nguồn gốc từ pGEX-2T và chứa một trang web nhận dạng thrombin. PGEX-5X-1, pGEX-5X-2, và pGEX-5X-3 là các dẫn xuất của pGEX-3X và có vị trí nhận dạng Factor Xa (Bảng 1,1).
PGEX-2TK có MCS khác với các vectơ khác. PGEX-2TK được thiết kế để cho phép phát hiện protein biểu hiện bằng cách dán nhãn trực tiếp các sản phẩm được gắn thẻ trong ống nghiệm. Vector này chứa trình tự nhận dạng cho tiểu đơn vị xúc tác của protein kinase phụ thuộc cAMP thu được từ cơ tim. Vị trí protein kinase nằm giữa vị trí nhận dạng thrombin và MCS. Các protein biểu hiện có thể được dán nhãn trực tiếp bằng cách sử dụng protein kinase và [γ-32P] ATP và dễ dàng phát hiện bằng các kỹ thuật phóng xạ hoặc chụp ảnh tự động tiêu chuẩn. PGEX-2TK là một dẫn xuất của pGEX-2T, và protein gắn thẻ của nó có thể được cắt bằng thrombin.
Nói chung, các vectơ pGEX cung cấp cả ba khung đọc dịch mã bắt đầu với vị trí hạn chế EcoRI (Hình 1,1). PGEX-1λT, pGEX-6P-1, pGEX-4T-1, và pGEX-5X-1 có thể trực tiếp chấp nhận và thể hiện các hạt dao cDNA được phân lập từ thư viện λgt11.
Tham khảo Phụ lục 2 (Vùng kiểm soát đối với vectơ pGEX) để biết danh sách các vùng kiểm soát của vectơ pGEX. Trình tự DNA đầy đủ và dữ liệu trang web hạn chế có sẵn từ GenBank™. Số đăng ký GenBank được liệt kê trong Phụ lục 2 (Vùng kiểm soát đối với vectơ pGEX).
Hình 1,1.Bản đồ các vectơ GST hiển thị các khung đọc và các tính năng chính. Tất cả 13 vectơ có các codon dừng trong cả ba khung đọc ở hạ nguồn từ MCS (không được mô tả trong bản đồ này). Xem Phụ lục 2 (Vùng kiểm soát đối với vectơ pGEX) để biết vùng kiểm soát của 13 vectơ.
Chọn vector thích hợp để khớp với khung đọc của hạt dao được nhân bản.
Hãy xem xét protease và điều kiện phân tách nào phù hợp nhất cho việc chuẩn bị protein đích của bạn.
PGEX-6P PreScission protease vector cung cấp phương pháp hiệu quả nhất để phân tách và tinh chế các protein gắn thẻ GST. Sự phân tách riêng của địa điểm được thực hiện với sự cố định đồng thời của protease trên cột. Protease có hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp để tất cả các bước có thể được thực hiện trong phòng lạnh để bảo vệ tính toàn vẹn của protein đích. Enzyme phân tách và thẻ GST được loại bỏ trong một bước duy nhất.