PCR thời gian thực đa nhân

Multiplex qPCR sử dụng hóa học dựa trên đầu dò là một ứng dụng đòi hỏi thường đòi hỏi phải tối ưu hóa và xác thực rộng rãi.

Sự kết hợp của   bộ PCR thời gian thực đa kênh Eppendorf ® Mastercycler ® ep realplex 4 S và bộ qPCR NHANH của ĐẦU DÒ KAPA từ Kapa Bistems cung cấp giải pháp hàng đầu trong ngành để đạt được hiệu suất cao, tốc độ cao mà không cần phải tối ưu hóa mở rộng.

Giới thiệu

Những phát triển gần đây trong PCR đa nhân giúp nhanh chóng xác định, kiểu gen và định lượng nhiều mục tiêu DNA đồng thời trong một phản ứng duy nhất. Multiplex qPCR đặc biệt phù hợp với các ứng dụng như phân tích biểu hiện gen, kiểu gen SNP, biến đổi số sao chép (CNV), phát hiện sinh vật biến đổi gen (GMO), phát hiện mầm bệnh và theo dõi hiệu quả của điều trị thuốc.

Ưu điểm của qPCR đa dạng bao gồm tăng thông qua, giảm chi phí phản ứng và bảo tồn vật liệu mẫu hạn chế. QPCR đa nhân thường đòi hỏi tối ưu hóa đáng kể và các xét nghiệm riêng lẻ phải được xác thực trước khi ghép kênh. Thiết kế xét nghiệm cẩn thận rất quan trọng để tránh sự bổ sung mồi và đảm bảo khuếch đại hiệu quả của từng bộ khuếch đại mục tiêu.

Đa qPCR yêu cầu một thiết bị có khả năng phát hiện đa kênh và một thuốc thử qPCR có khả năng duy trì hiệu suất phản ứng cao của tất cả các bộ khuếch đại ở định dạng đa kênh.   Hệ thống PCR thời gian thực Eppendorf ® Mastercycler ® e Prealplex 4 S có thiết bị điều khiển nhiệt siêu nhanh, điều khiển bằng Peltier (gia nhiệt 6 °C/giây và làm mát 4 °C/giây), cho phép hoàn thành phản ứng qPCR 40 chu kỳ trong vòng dưới 1 giờ   Thiết bị Erealplex 4 Peltier cũng đảm bảo kiểm soát nhiệt độ chính xác cũng như tính đồng nhất khối cao, các thông số thiết yếu cho qPCR hiệu suất cao. Mô-đun quang học bao gồm một dãy 96 đèn LED được chọn trước và cân bằng để tất cả các giếng đều được kích thích đồng nhất, loại bỏ yêu cầu về thuốc nhuộm tham chiếu thụ động (ví dụ, ROX), được sử dụng để bình thường hóa tín hiệu huỳnh quang trong nhiều thiết bị qPCR thông thường. Do đó, kênh thường được sử dụng cho thuốc nhuộm tham chiếu thụ động có sẵn để ghép kênh. Th erealplex 4also sử dụng công nghệ Ống nhân quang học hình ảnh (PMT) để phát hiện tín hiệu, kỹ thuật phát hiện nhạy cảm nhất và giá cả phải chăng hiện có.  Eppendorf^® Mastercycler ® e prealplex⁴ S là một hệ thống bốn kênh và cung cấp sự linh hoạt đầy đủ của đa kênh thông qua các bộ lọc khí thải tương ứng với 520/550/580/605 nm.

Bộ qPCR NHANH ĐẦU DÒ KAPA từ hệ thống sinh thái Kapa chứa hỗn hợp chủ sẵn sàng để sử dụng cho PCR thời gian thực cao độ nhạy và chính xác bằng cách sử dụng các hóa chất thăm dò theo trình tự cụ thể. Các bộ dụng cụ này tương thích với nhiều loại hóa chất thăm dò bao gồm TaqMan^®, đầu dò GIẢI PHÓNG, đầu dò bọ cạp và đèn hiệu phân tử. Bộ qPCR NHANH ĐẦU DÒ KAPA đã được xây dựng đặc biệt cho qPCR tốc độ cao, mà không ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng và khả năng tái tạo. Bộ dụng cụ được tối ưu hóa cho tính linh hoạt và phù hợp cho một loạt các ứng dụng bao gồm biểu hiện gen, kiểu gen SNP và ghép kênh. Bộ qPCR NHANH ĐẦU DÒ KAPA được cung cấp với khởi động nóng dựa trên kháng thể, cho phép thời gian giữ kích hoạt ban đầu ngắn ở 95 °C. Các giao thức PCR sử dụng ĐẦU DÒ KAPA NHANH dựa trên thời gian mở rộng giảm, cho phép giảm đáng kể thời gian chu kỳ PCR mà không có nguy cơ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng.

Phương pháp

Để chứng minh khả năng thực hiện qPCR đa nhân nhanh mà không ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng, một bộ tám gấp 2 lần (Hình 1) hoặc bốn pha loãng chuỗi 4 lần DNA của bộ gen người đã được khuếch đại bằng cách sử dụng đơn lẻ (Hình 2) hoặc song công ( Hình3) xét nghiệm và giao thức đạp xe nhanh (3 phút ở 95 °C kích hoạt ban đầu, 40 chu kỳ 3 giây ở 95 °C và 20 giây ở 60 °C). Việc khuếch đại được thực hiện trong các tấm Eppendorf ® Twin.tec với màng đệm nhiệt quang học rõ ràng sử dụng  hệ thống PCR thời gian thực 4 S. Hai xét nghiệm qPCR dựa trên đầu dò thủy phân đã được sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 1). Hiệu chuẩn thuốc nhuộm cho xét nghiệm Cal Fluor ® Gold 540 TaqMan được thực hiện theo mô tả của Biossearch Technologies.

Các biểu đồ khuếch đại log thu được và các đường cong tiêu chuẩn cho mỗi xét nghiệm được thực hiện riêng biệt (Hình 2) và trong duplex (Hình 3) chỉ ra rằng không có ngưỡng chu kỳ (C_T), cũng không phải hiệu quả của các phản ứng qPCR bị tổn hại do kết quả của định dạng đa nhân. Sự khác biệt trong giá trị C trung bình (ΔC_T) cho mỗi pha loãng gấp 4 lần trong cả hai phản ứng đơn và song công cho thấy hiệu suất tương đương giữa các phản ứng đơn và song công (Bảng 2). Giao thức nhanh giúp tiết kiệm thời gian 56 phút so với giao thức chậm thông thường (10 phút ở 95 °C kích hoạt ban đầu, 40 chu kỳ 15 giây ở 95 °C và 60 giây ở 60 °C) khi được thực hiện trên hệ thống PCR thời gian thực realplex4 S.

Hình 1. Kết quả có khả năng tái tạo cao và hiệu quả cho cả hai bộ khuếch đại trên một chuỗi DNA bộ gen người pha loãng 8 điểm thu được khi thử nghiệm in hai mặt bằng cách sử dụng giao thức chu kỳ nhanh. Các đường cong tiêu chuẩn được tạo ra bằng cách pha loãng gấp 2 lần DNA của bộ gen người (40 - 0,3125 ng trên phản ứng 20 μL), được thử nghiệm bằng bốn ruplicate.

Hình 2. Phản ứng qPCR đơn. Dữ liệu cho thấy các biểu đồ khuếch đại nhật ký của một tập hợp bốn pha loãng chuỗi 4 lần của hgDNA từ 40 - 0,625 ng cho mỗi phản ứng bằng cách sử dụng một giao thức chu kỳ nhanh 2 bước. Dữ liệu thể hiện bốn bản sao cho mỗi pha loãng DNA. Các xét nghiệm ActB và ERBB2 được hiển thị tương ứng với màu xanh lá cây và màu cam.

Hình 3. Phản ứng qPCR hai chiều. Dữ liệu cho thấy các biểu đồ khuếch đại nhật ký của một tập hợp bốn pha loãng chuỗi 4 lần của hgDNA từ 40 - 0,625 ng cho mỗi phản ứng bằng cách sử dụng một giao thức chu kỳ nhanh 2 bước. Dữ liệu thể hiện bốn bản sao cho mỗi pha loãng DNA. Các xét nghiệm ActB và ERBB2 được hiển thị tương ứng với màu xanh lá cây và màu cam.