Giao thức PCR tiêu chuẩn

Cách thực hiện PCR

Thiết lập phản ứng chuỗi polymerase tiêu chuẩn (PCR) bao gồm các bước bù:

1. Thêm Yêu cầu  dấu hoa thị và mẫu cho ống PCR.
2. Trộn và ly tâm.
   *Thêm dầu khoáng để ngăn ngừa sự bốc hơi trong một vòng xoáy nhiệt mà không có nắp được làm nóng.
3. Khuếch đại mỗi vòng lặp nhiệt và các thông số mồi.
4. Đánh giá DNA khuếch đại bằng điện di gel agarose sau đó nhuộm ethidium bromide.

Các bước này được trình bày chi tiết hơn cùng với các mẹo chọn chất liệu và chất thử. Đây là một giao thức PCR cơ bản sử dụng Taq DNA polymerase.

Các bước PCR và các thành phần PCR thiết yếu

Xử lý sự cố phản ứng PCR liên quan đến nhiều yếu tố. Xem đoạn phim hoạt hình này để tìm hiểu cách chọn đúng thành phần và điều kiện đạp xe cho nhu cầu của bạn có thể giúp đạt được kết quả tối ưu.

Tìm các giao thức bổ sung cho các polymerase khác hoặc các kỹ thuật PCR nâng cao trong phần Giao thức trong Hướng dẫn công nghệ PCR của chúng tôi.

Tìm hiểu thêm về PCR tiêu chuẩn, bao gồm nội dung, trên trang PCR Basics của chúng tôi.

Thuốc thử: Cần điều gì cho PCR?

  

Taq DNA polymerase là một enzyme ổn định nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn thermophilic Thermus aquaticus.  Viêm I thường được sử dụng để khuếch đại các mảnh DNA trong PCR. Enzyme ở dạng tái tổ hợp, được biểu hiện trong E. coli. Nó có thể chịu được sự gia nhiệt lặp đi lặp lại đến 95 °C (như được yêu cầu bởi kỹ thuật PCR) mà không làm giảm đáng kể hoạt động. Enzyme có trọng lượng phân tử xấp xỉ 94 kDa theo SDS mà không có hoạt động endonuclease hoặc exonuclease có thể phát hiện. Nó có hoạt tính polymerase 5' →3' và hoạt tính exonuclease 5'→3'. Mỗi lô  DNA polymerase Taq được thử nghiệm để khuếch đại PCR và giải trình tự sợi kép. Enzyme được cung cấp ở  mức 5units / µL và đi kèm với bộ đệm phản ứng tối ưu hóa 10x.

  DNA polymerase tiêu chuẩn Taq

Sử dụng bảng dưới đây để chọn hỗn hợp thích hợp của Taq DNA polymerase cho các điều kiện phản ứng của bạn. Chọn trong số các công thức nhuộm màu đỏ hoặc rõ ràng có và không có magiê clorua (MgCl₂) hoặc readymix được chuẩn bị sẵn hoặc hỗn hợp chính với bộ đệm và dNTP.

Unit Definition: Một đơn vị kết hợp 10 nmol tổng triphosphat deoxyribonucleoside vào DNA kết tủa axit trong 30 phút ở 74 °C.

Quy trình: Các bước PCR

Các điều kiện tối ưu cho nồng độ của Taq DNA polymerase, mẫu DNA, mồi và MgCl₂ sẽ phụ thuộc vào hệ thống đang được sử dụng. Có thể cần phải xác định các điều kiện tối ưu cho từng thành phần riêng lẻ. Điều này đặc biệt đúng đối với  DNA polymerase Taq, các thông số chu kỳ và nồng độ MgCl 2. Enzyme và MgCl_{2 được} chuẩn độ để xác định hiệu quả tối ưu.

1. Thêm thuốc thử vào ống có kích thước phù hợp theo thứ tự được cung cấp trong bàn. (Chọn bảng thích hợp để thiết lập phản ứng: Thuốc thử tiêu chuẩn hoặc readymix.) Đối với một số lượng lớn các phản ứng, một mastermix không có mẫu nên được thiết lập và phân tách thành các ống phản ứng. Vào cuối, mẫu phải được thêm vào các ống thích hợp.
   

Phản ứng PCR tiêu chuẩn

*Mua bộ đệm và Ta qpolymerase cùng nhau: D1806, D430 9or D4545

Phản ứng tái trộn PCR

2. Hòa nhẹ bằng xoáy nước và ly tâm nhanh để thu gom tất cả các bộ phận xuống đáy ống.

Lưu ý: Thêm 50 µL dầu khoáng vào đầu mỗi ống để ngăn sự bay hơi nếu sử dụng bộ phận tuần hoàn nhiệt không có nắp được làm nóng.

3. Khuếch đại. Các thông số khuếch đại sẽ thay đổi tùy thuộc vào mồi và vòng xoáy nhiệt được sử dụng. Có thể cần phải tối ưu hóa hệ thống cho từng mồi, mẫu và vòng xoáy nhiệt.

Thông số đạp xe điển hình

khuyến nghị sử dụng 25-30 chu kỳ khuếch đại.

4. DNA khuếch đại có thể được đánh giá bằng điện di gel agarose và nhuộm ethidium bromide tiếp theo.

    Lớp phủ dầu khoáng có thể được loại bỏ bằng một chiết xuất chloroform duy nhất (1:1), phục hồi pha nước.

Thuốc thử điện di axit nucleic

• Agarose (gel dự đoán, bột, v.v.)
•  Phiên bản Buffe như MOPS-EDTA-sodium acetate, tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc tris-borate-EDTA (TBE)
• Dung dịch nạp gel và bộ đệm tải mẫu cho RNA
• Vết bẩn điện di hoặc esuch dy như ethidium bromide

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Tuyên bố Giấy phép Nhãn

THÔNG BÁO CHO NGƯỜI MUA: DISCLAIMER OF LICENSE

Không có giấy phép nào được chuyển nhượng khi mua sản phẩm này theo bất kỳ bằng sáng chế nào của Hoa Kỳ số 5.804.375, 5.994.056, 6.171.785, 6.214.979, 5.538.848, 5.723.591, 5.876.930, 6.030.787 và 6.258.569, và bằng sáng chế tương ứng bên ngoài Hoa Kỳ, hoặc bất kỳ bằng sáng chế hoặc ứng dụng bằng sáng chế nào khác, liên quan đến các quá trình nhuộm an toàn nuclease và DSDNA 5. Để biết thêm thông tin liên hệ với Giám đốc Cấp phép, Hệ thống Sinh học Ứng dụng, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404, Hoa Kỳ