Định lượng PCR Cơ bản
PCR định lượng (chính thức định lượng thực tế PCR, qPCR) phát hiện dựa trên kỹ thuật PCR cơ bản và cho phép các nhà nghiên cứu ước tính số lượng vật liệu khởi đầu trong một mẫu. Vì các sản phẩm được phát hiện khi phản ứng tiến hành, qPCR có một phạm vi phân tích động rộng hơn nhiều so với PCR điểm cuối thông thường; từ một bản sao duy nhất đến khoảng 101 1copies có thể được phát hiện trong một lần chạy. PCR thời gian thực định lượng và phát hiện amplicon tiếp theo được thực hiện theo định dạng ống đóng giúp loại bỏ nhu cầu xử lý sau PCR, chẳng hạn như điện di gel và giảm đáng kể nguy cơ nhiễm chéo.
Các nguyên tắc cơ bản của qPCR được thảo luận trên trang này và các cơ chế của các hóa chất phát hiện phổ biến được mô tả trong PCR định lượng và Phương pháp phát hiện PCR kỹ thuật số.
Basic Principles
Khi thực hiện qPCR, thuốc nhuộm phóng viên huỳnh quang được sử dụng như một phép đo gián tiếp lượng axit nucleic có trong mỗi chu kỳ khuếch đại. Sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng các phân tử sản phẩm PCR tích lũy theo cấp số nhân (amplobions) được tạo ra trong các pha lặp lại của phản ứng (xem phản ứng chuỗi polymerase). Các phân tử phóng viên được phân loại là; thuốc nhuộm liên kết DNA sợi kép (dsDNA), thuốc nhuộm liên hợp với mồi, hoặc oligonucleotide liên hợp thuốc nhuộm bổ sung, được gọi là đầu dò (phương pháp PCR định lượng và PCR kỹ thuật số).
Việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết dsDNA, chẳng hạn như SYBR® Green I, đại diện cho dạng hóa học phát hiện đơn giản nhất. Khi tự do trong dung dịch hoặc chỉ có DNA sợi đơn (ssDNA) hiện diện, thuốc nhuộm SYBR Green I phát ra ánh sáng ở cường độ tín hiệu thấp. Khi PCR tiến triển và số lượng dsDNA tăng lên, nhiều thuốc nhuộm liên kết với các bộ khuếch đại và do đó, cường độ tín hiệu tăng lên.
Ngoài ra, một đầu dò (hoặc sự kết hợp của hai tùy thuộc vào hóa học phát hiện) có thể thêm một mức độ đặc hiệu phát hiện ngoài thuốc nhuộm liên kết dsDNA, vì nó liên kết với một vùng cụ thể của mẫu nằm giữa các mồi. Định dạng đầu dò được sử dụng phổ biến nhất là Đầu dò được dán nhãn kép (DLP; còn được gọi là thủy phân hoặc Đầu dò TaqMan ®). DLP là một oligonucleotide với nhãn huỳnh quang 5, ví dụ, 6-FAM™ và phân tử làm nguội 3, chẳng hạn như một trong những quenchers tối, ví dụ, BHQ®1 hoặc OQ™ (PCR định lượng và phương pháp phát hiện PCR kỹ thuật số). Các đầu dò này được thiết kế để lai tạo với mẫu giữa hai mồi và được sử dụng kết hợp với một DNA polymerase vốn có hoạt động exonuclease sinh hoạt từ 5 đến 3. Khi DLP tự do trong giải pháp, cường độ tín hiệu thấp vì thuốc nhuộm phóng viên ở gần với phân nửa của bộ giảm tốc. Vì nhiều mẫu được tạo ra trong quá trình phản ứng, nhiều đầu dò khác lai với khuôn mẫu, do đó được phân cắt bởi hoạt động exonuclease 5 đến 3 của DNA polymerase đang tiến triển. Cường độ tín hiệu huỳnh quang tăng lên khi thuốc nhuộm sinh hoạt 5 được giải phóng vào giải pháp. Việc sử dụng đầu dò được dán nhãn bằng thuốc nhuộm phóng viên khác nhau cho phép phát hiện và định lượng đồng thời nhiều mục tiêu trong một phản ứng (multiplex).
Một lần chạy qPCR điển hình bao gồm các chu kỳ lặp đi lặp lại của các lần ủ nhiệt độ luân phiên, Quy trình đạp xe 3,1. Hồ sơ này thường được sử dụng khi thuốc nhuộm gắn với dsDNA, Beacon phân tử hoặc đầu dò Scorpion ® là hóa chất phát hiện được chọn cho qPCR. Sự mở rộng mồi hiệu quả nhất ở 72 °C bởi vì đây là nhiệt độ tối ưu cho sự rước của hầu hết các polymerase DNA. Ở 72 °C, trùng hợp xảy ra với tốc độ khoảng 100 base mỗi giây. Tuy nhiên, vẫn có sự rước ở nhiệt độ thấp hơn đủ để khuếch đại các mẫu ngắn hơn. Các amplions qPCR thường ngắn hơn (<200 base) so với các sản phẩm PCR thông thường, do đó việc mở rộng thường được kết hợp với ủ trong một bước duy nhất ở 60 °C khi làm việc với các Probles kép (Cycling Procedure 3,2).
Quy trình đạp xe 3,1
Một ví dụ về hồ sơ qPCR tiêu chuẩn sử dụng thuốc nhuộm liên kết dsDNA, Beacon phân tử hoặc phát hiện Scorpions ® Probe.
- Sự biến tính ban đầu: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 95 °C và mẫu được ủ trong 2–10 phút (thời gian phụ thuộc vào cơ chế khởi động nóng enzyme polymerase) để đảm bảo rằng tất cả các mục tiêu phức tạp (dsDNA) được tách ra và được sợi đơn và có sẵn để khuếch đại
- Đạp xe:
- Biến tính: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 95 °C trong 10 giây để làm tan chảy tất cả dsDNA.
- Ủ: Nhiệt độ được hạ xuống 60 °C trong 30 giây để thúc đẩy mồi và đầu dò (nếu có) liên kết với mẫu.
- Kéo dài: Kéo dài tiếp theo xảy ra ở nhiệt độ tăng 72 °C, là tối ưu cho đám rước TaqDNA polymerase. Thời gian mở rộng sẽ phụ thuộc vào kích cỡ bộ khuếch đại (30 giây trên 1 kb). Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài mong muốn của amplicon và enzyme được sử dụng. Vì bộ khuếch đại qPCR ngắn, điều này thường là 5–30 giây.
- Biến tính: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 95 °C trong 10 giây để làm tan chảy tất cả dsDNA.
- Lặp lại: Các bước 1–3 được lặp lại, thường là trong 40 chu kỳ.
Quy trình đạp xe 3,2
Một ví dụ về hồ sơ qPCR đạp xe hai bước để phát hiện DLP.
- Sự biến tính ban đầu: Nhiệt độ tăng lên 95 °C và phản ứng được ủ trong 2–10 phút (tùy thuộc vào tính chất khởi đầu nóng của enzyme polymerase)
- Đạp xe:
- Biến tính: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 95 °C trong 10 giây để làm tan chảy tất cả dsDNA.
- Ủ và Mở rộng: Nhiệt độ được hạ xuống 60 °C trong 30 giây để thúc đẩy sự liên kết mồi với khuôn mẫu và kéo dài sau đó xảy ra do hoạt động đầy đủ của DNA polymerase ở nhiệt độ này.
- Lặp lại: Các bước 1–2 được lặp lại, thường là trong 40 chu kỳ.
Sự thay đổi trong huỳnh quang trong quá trình phản ứng được đo bằng một máy chu trình nhiệt PCR thời gian thực. Các thiết bị PCR thời gian thực chuyên dụng kết hợp chu kỳ nhiệt độ với một thiết bị quang học. Đơn vị quang học cung cấp ánh sáng ở bước sóng thích hợp để kích thích fluorophore và phát hiện bức xạ thu được. Nhiều dụng cụ hiện đại có màn hình hiển thị gắn hoặc màn hình máy tính gần đó, cho phép phản ứng được theo dõi khi nó tiến triển (Hình 3,1).
Hình 3,1.Ví dụ Dữ liệu xét nghiệm qPCR. A) Các giai đoạn khác nhau của phản ứng. Đường cơ sở: Nồng độ ban đầu của mẫu thấp; do đó, cường độ huỳnh quang quá thấp để có thể phát hiện và chỉ có tín hiệu nền là rõ ràng. Hàm mũ: Sau khi năng suất mục tiêu đã đạt đến ngưỡng phát hiện, được hiển thị dưới dạng đường ngưỡng màu đỏ, quá trình phản ứng có thể được thực hiện thông qua pha hàm mũ. Tuyến tính: Khi nồng độ mẫu làm tăng nồng độ DNA polymerase có sẵn sẽ giảm và tốc độ phản ứng giảm. Cao nguyên: Phản ứng ở mức năng suất tối đa. B) Các phản ứng riêng lẻ được đặc trưng bởi chu kỳ mà huỳnh quang lần đầu tiên tăng lên trên ngưỡng, được gọi là chu kỳ định lượng (CQ). Nếu vật liệu ban đầu dồi dào, độ khuếch đại được quan sát thấy trong các chu kỳ trước đó và CQ thấp hơn. Nếu vật liệu ban đầu khan hiếm, độ khuếch đại được quan sát thấy trong các chu kỳ sau và CQ cao hơn. Mối tương quan giữa huỳnh quang, CQ và lượng sản phẩm khuếch đại này cho phép định lượng mẫu trên một dải động rộng.
Định lượng và phân tích các mục tiêu gDNA
PCR thời gian thực định lượng có thể dễ dàng được áp dụng để phân tích các mục tiêu gDNA. Các nghiên cứu như vậy có thể là
xác định kiểu gen / SNP, phân tích methyl hóa, sàng lọc các chuỗi chuyển gen hoặc theo dõi các chèn và xóa.
Định lượng và phân tích bản sao mRNA
Một ứng dụng phổ biến của qPCR là phân tích biểu hiện gen, ví dụ, so sánh nồng độ mRNA của một gen quan tâm giữa các mẫu điều khiển và được điều trị. MRNA có thể được định lượng thông qua quá trình RT-qPCR hai bước hoặc một bước (xem PCR thời gian thực định lượng đảo ngược, để biết thêm chi tiết về phản ứng RT).
RT-qPCR hai bước
Các phản ứng phiên mã ngược và qPCR được thực hiện tuần tự trong các ống riêng biệt. Tổng RNA hoặc ít
phổ biến hơn poly(A)+ RNA, được sử dụng làm vật liệu ban đầu và cDNA được tạo ra bằng cách kéo dài từ primers oligo-DT,
primers ngẫu nhiên, một sự pha trộn của primers / primers ngẫu nhiên oligo-DT, hoặc mồi đặc hiệu gen sử dụng enzyme phiên mã ngược. Một phân lượng của phản ứng này sau đó được thêm vào qPCR.
RT-qPCR một bước
Khi các phản ứng phiên mã ngược và qPCR được kết hợp thành một ống, thiết lập thử nghiệm được đơn giản hóa
và có nguy cơ nhiễm bẩn thấp hơn vì không có yêu cầu xử lý thêm mẫu.
Định lượng và phân tích bản sao ncRNA
Hầu hết các RNA không mã hóa dài hơn 100 nucleotide và do đó, có thể được phát hiện và định lượng bằng RT-qPCR
với các kỹ thuật tương tự được sử dụng để phân tích mRNA. Ngược lại, các RNA không mã hóa ngắn, chẳng hạn như các RNA micro và piwi, về cơ bản là chiều dài của một mồi PCR duy nhất. Do đó, một kỹ thuật kéo dài các RNA ngắn này là cần thiết trước khi thực hiện qPCR. Hai cách tiếp cận chính được áp dụng trong các hệ thống thương mại sẵn có: 1) Sử dụng mồi RT mạch nhánh và 2) đuôi poly-A tiếp theo là RT với một mồi điều hợp oligo-DT (Hình 3,2). Một cách tiếp cận thay thế được phát triển bởi Casoldi và cộng sự, không có sẵn trên thị trường, sử dụng sự phối tử của một phân tử thích ứng với tất cả RNA trong mẫu và thiết kế mồi cụ thể để phân biệt giữa các mục tiêu mong muốn1,2.
Cách tiếp cận mồi RT vòng lặp hệ thống đã được phát triển và thương mại hóa bởi các hệ thống sinh học ứng dụng (hiện tại là Life Technologies / Thermo) cho qPCR3 dựa trên đầu dò TaqMan tiếp theo. Như minh họa trong Hình 3,2A, đầu 5 của mồi RT có thể cặp base với một vùng vài nucleotide từ đầu 3 của chính nó để tạo ra một thân nối base được tách ra bởi một vòng không ghép nối. Tất cả ngoại trừ một số nucleotide cuối cùng ở đầu 3 của primer RT là phổ quát, nghĩa là chúng chứa cùng một trình tự trong tất cả các primers mRNA. Một vài nucleotide cuối cùng kéo dài 3 từ thân được bổ sung thêm cho đầu 3 của một miRNA đích. Sự mở rộng của primer dọc theo một mẫu miRNA tạo ra một
cDNA có thể được khuếch đại với một primer chuyển tiếp đặc hiệu mRNA và một primer đảo ngược phổ quát, thứ hai trong số đó
bổ sung cho đầu 5 của primer RT vòng gốc.
Tất cả các phương pháp miRNA qPCR thương mại khác, bao gồm thương hiệu MystiCq ® của chúng tôi, sử dụng đuôi poly-A để kéo dài miRNA, như mô tả bởi Shi và Chiang4. Poly(A) polymerase (PAP), một enzyme độc lập với khuôn mẫu, xúc tác việc chuyển dư lượng adenosine từ ATP đến đầu 3 của bất kỳ RNA nào. Như minh họa trong Hình 3,2B, RT sau đó có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một mồi oligo-DT. Bộ mồi oligo-DT bao gồm một trình tự điều hợp ở đầu 5 của nó, cho phép qPCR tiếp theo với một bộ mồi hướng về phía trước bổ sung cho một miRNA cụ thể và một bộ mồi ngược bổ sung cho trình tự bộ điều hợp.
Hình 3,2.Có hai phương pháp thương mại có sẵn cho RT và qPCR của miRNA. A) Một primer vòng được sử dụng để làm nguyên tố bước RT sau khi lai tạo đến đầu 3 của miRNA. Sự mở rộng PCR thông qua vòng lặp dẫn đến một miRNA kết hợp và trình tự phổ quát đủ dài để khuếch đại B) bổ sung một poly đuôi vào miRNA cung cấp một vị trí mồi cho một primer bao gồm một đường oligo-DT và một trình tự mồi phổ quát. Nucleic acid research by Oxford University Press. Được sao chép với sự cho phép của Oxford University Press ở định dạng tái sử dụng trong sách / sách điện tử thông qua Trung tâm chứng nhận bản quyền.
Cả hai phương pháp thương mại đều có lợi thế và bất lợi. Mồi vòng lặp hệ thống cho phép 2 bước RT-qPCR, trong khi hầu hết các phương pháp đuôi poly-A yêu cầu một bước bổ sung cho RT trước qPCR. Có những sản phẩm kết hợp đuôi poly-A và RT trong một phản ứng duy nhất cho khả năng cầm PAP 2 bước/RT-qPCR. Tuy nhiên, việc phát hiện có thể ít nhạy cảm hơn với cách tiếp cận này (kết quả nội bộ chưa được công bố). Ngược lại, đuôi poly-A theo sau bởi RT tạo ra một nhóm cDNA ổn định có thể được sử dụng để phát hiện bất kỳ microRNA, mRNA hoặc RNA khác, ngay lập tức hoặc bất kỳ lúc nào trong tương lai. Với cách tiếp cận vòng gốc/TaqMan, cần có một nguyên tố khác nhau để phát hiện mỗi mRNA. Có thể thêm nhiều mồi vòng gốc vào cùng một nhóm phản ứng RT 5and nhóm mồi RT cho nhiều mRNA có thể được mua từ Life Technologies để thực hiện multiplex RT. Tuy nhiên, không có lựa chọn nào cho phép phát hiện qPCR các mRNA được phát hiện vào một ngày sau đó, cũng không cho phép qPCR phát hiện mRNA từ cùng một cDNA. Hệ thống được mô tả bởi Castoldi etal 1, 2is duy nhất ở chỗ nó cung cấp các phương tiện để phát hiện các phân tử mRNA, tiền thân và được xử lý hoàn toàn từ cùng một mẫu RNA.
qPCR Requirements
Nhạc cụ
Nhiều dụng cụ qPCR đã được thiết kế để hỗ trợ một loạt các ứng dụng cụ thể, ví dụ, tương phản khả năng của thiết bị thông lượng cao ABI 7900 sử dụng tải tự động của các tấm 384 giếng với Illumina sản xuất và bán dụng cụ Eco hỗ trợ một tấm 48 giếng duy nhất. Do đó, dụng cụ phù hợp nhất đáp ứng nhu cầu của nghiên cứu. Người dùng mong muốn chọn một dụng cụ với phần mềm thân thiện với người dùng thực hiện các chức năng mong muốn nhất và có tính linh hoạt về đầu ra dữ liệu để có thể dễ dàng thao tác trong các gói phần mềm phân tích thống kê hạ nguồn. Điều này làm giảm thời gian cần thiết để đào tạo nhân viên và do đó bắt đầu tạo ra kết quả. Các tính năng bổ sung cần thiết bao gồm khối PCR hoàn toàn đồng nhất (độ lệch tối đa tuyệt đối là 1 CQ = 2 lần trên 96 giếng sao chép) và một hệ thống quang học kích thích và phát hiện phát xạ một cách nhạy cảm và đồng đều nhất trên một phạm vi bước sóng rộng. Điều này cho phép nhiều lựa chọn fluorophore và cho phép ghép kênh. Các tính năng khác cần xem xét là chi phí vận hành liên quan đến vật tư tiêu hao cụ thể, ví dụ, nếu một tấm vi mô tiêu chuẩn không được sử dụng cho các phản ứng và cũng là sự thuận tiện của việc tải tấm / ống không phải định dạng tiêu chuẩn.
Template
Rất ít bản sao của axit nucleic đích (tương đương với khoảng 100 pg gDNA hoặc cDNA) được yêu cầu để bắt đầu qPCR. Để giảm thiểu ô nhiễm với các chất ức chế phản ứng, lượng mẫu bắt đầu nên được giữ ở mức tối thiểu cần thiết để đạt được định lượng chính xác. Khi vật liệu ban đầu là RNA, thiết kế mồi và điều trị DNase I sẽ làm giảm các tín hiệu có thể được tạo ra từ sự ô nhiễm gDNA.
Mồi
Cho dù sử dụng thuốc nhuộm liên kết dsDNA hoặc hóa học phát hiện dựa trên đầu dò, thiết kế mồi chất lượng cao là một trong những bước thử nghiệm quan trọng nhất trong qPCR. Để thảo luận chi tiết về thiết kế xét nghiệm, PCR, qPCR, Thiết kế xét nghiệm dPCR. Để tối đa hóa độ nhạy và độ đặc hiệu, bất kỳ sửa đổi cần thiết nào, chẳng hạn như axit nucleic khóa, phải được bao gồm (qPCR Detection Chemistry).
Probe(s)
Khi sử dụng đầu dò làm cơ chế phát hiện amplicon, các bộ điều chỉnh độ sáng mồi và các sản phẩm không đặc hiệu không được phát hiện nhưng nên tránh vì chúng có thể làm giảm hiệu suất phản ứng. Để tối đa hóa độ nhạy và tính đặc hiệu, loại đầu dò thích hợp cho ứng dụng nên được chọn và bất kỳ sửa đổi cần thiết nào, chẳng hạn như axit nucleic khóa, bao gồm (qPCR Detection Chemistry).
dNTP
PCR tiêu chuẩn và qPCR chính mixe chứa dATP, dCTP, dGTP và dTTP. Tuy nhiên, một số hỗn hợp có sẵn thay thế dTTP bằng dUTP. Các sản phẩm từ các phản ứng trước đó chạy với dUTP sẽ chứa uracil thay vì thymine. Sau đó, chúng dễ bị phân cắt bởi uracil-DNA-Glycosylase (UNG). Do đó, ủ trước các phản ứng tiếp theo với UNG ngăn ngừa ô nhiễm carryover giữa các phản ứng. Để có hiệu quả, tất cả các PCR trong phòng thí nghiệm phải sử dụng dUTP.
Magiê
Magiê clorua (MgCl2) là cần thiết cho hoạt động sinh dục exonuclease ngược, Taq DNA polymerase và Taq DNA 5 đến 3 exonuclease. Nồng độ mg 2+ tối ưu cho các phản ứng có chứa DLPs thường nằm trong khoảng 3–6 mM. Phần lớn các hỗn hợp chính chứa MgCl2, tuy nhiên, đôi khi cần phải tối ưu hóa nồng độ, vì vậy một ống bổ sung MgCl 2is tinh khiết thường được bao gồm với sản phẩm hỗn hợp chính (xem Tối ưu hóa và Xác thực xét nghiệm). Trong một số trường hợp, cần phải có hỗn hợp phản ứng không chứa MgCl 2may để có thể sử dụng nồng độ thấp, ví dụ, khi sử dụng phát hiện Scorpions ® Probe.
Reverse Transcriptase
Một enzyme phiên mã ngược cung cấp sản lượng cDNA cao, trong khi vẫn duy trì hoạt động ở nhiệt độ cao, rất quan trọng đối với sự thành công của RT-qPCR. Hiệu suất ở nhiệt độ cao giúp đảm bảo rằng các vùng RNA có cấu trúc bậc hai đáng kể bị mất ổn định và có thể tiếp cận được đối với lai tạo và khuếch đại sau đó. Khi thực hiện RTqPCR một bước, hiệu suất nhiệt độ cao cho phép sử dụng mồiđặc trưng của bộ gen với nhiệt độ nóng chảy cao ( TM ), làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng. Khi thực hiện các giao thức hai bước, điều quan trọng là đảm bảo rằng enzyme dẫn đến năng suất cDNA tuyến tính và tỷ lệ từ RNA (xem phần Reverse Transcriptio nđể biết chi tiết về đánh giá RT).
DNA polymerase Taq
Giống như việc chọn phiên mã ngược thích hợp nhất cho RT, việc lựa chọn enzyme polymerase thích hợp là rất quan trọng. Một vấn đề cơ bản với DNA polymerase Taq tự nhiên là enzyme có hoạt tính còn lại ở nhiệt độ thấp. Liên kết mồi không đặc hiệu dẫn đến sự hình thành sản phẩm không đặc hiệu do kết quả của hoạt động polymerase còn lại này. DNA polymerase Taq bị chặn hoặc chặn hóa học ( hơi nước nóng) giúp khắc phục tình trạng này bằng cách ngăn chặn hoạt động của enzyme cho đến khi bước biến tính nhiệt độ cao bắt đầu.
Bộ đệm
Bộ đệm hoặc hỗn hợp chủ phản ứng, thường chứa dNTP, một chất ổn định DNA Taq, MgCl 2and. Thuốc nhuộm màu xanh lục I, ROX™, fluorescein và thuốc nhuộm tải trơ cũng có thể được bao gồm (Thuốc nhuộm kiểm soát tải), tùy thuộc vào hóa học phát hiện, dụng cụ và yêu cầu phản ứng. Các thành phần bộ đệm PCR và bộ ổn định thường là độc quyền của nhà sản xuất. Nếu được mua riêng, có thể linh hoạt tối đa, vì mỗi nguyên liệu có thể được tối ưu hóa riêng lẻ trong phản ứng. Tuy nhiên, ngược lại, trong khi mua các thành phần với nhau như một hỗn hợp chính làm giảm tính linh hoạt, nó làm tăng tính nhất quán và thuận tiện trong mẻ đồng thời giảm số lượng các bước ống dẫn và do đó, cơ hội lỗi và nhiễm bẩn.
Đang nạp thuốc nhuộm kiểm soát
Một số xoáy thuận nhiệt PCR thời gian thực đòi hỏi một chất nhuộm tải như ROX được đưa vào mỗi phản ứng để kiểm soát sự biến đổi trong hệ quang học và bình thường hóa sự khác biệt về cường độ tín hiệu. Tương tự như vậy, một số xoáy thuận nhiệt yêu cầu tín hiệu fluorescein ban đầu để tạo ra một nền ảo khi làm việc với các xét nghiệm nhuộm I màu xanh lục SYBR (có nền rất thấp). Chúng có thể được cung cấp trong hỗn hợp chính hoặc dưới dạng các thành phần riêng biệt để có thể sử dụng nồng độ thích hợp.
Hướng dẫn MIQE
Một vấn đề rõ ràng với việc sử dụng qPCR là rất dễ dàng để tạo ra các con số mà sau đó có thể dễ dàng được hiểu là kết quả định lượng. Tuy nhiên, điều này có thể gây hiểu nhầm tương đương vì kiểm soát chất lượng và phân tích sâu hơn có thể được yêu cầu để phân biệt giữa các yếu tố tiềm năng gây ra bởi thiết kế xét nghiệm, thực hiện hoặc phân tích dữ liệu không phù hợp. Việc công bố các dữ liệu rõ ràng có ý nghĩa mà không có kiểm soát chất lượng đầy đủ đã dẫn đến các báo cáo, tốt nhất, không liên quan đến sinh học hoặc lâm sàng và tệ nhất, là không chính xác.
Mỗi bước của quá trình thử nghiệm qPCR, từ thu nhận mẫu đến phân tích dữ liệu qPCR, dễ bị tổn thương với biến thiên6. Do đó, sự biến đổi có thể xảy ra trong quá trình chọn và xử lý mẫu, chiết xuất axit nucleic (có thể dẫn đến sự khác biệt về chất lượng gây ra thiếu khả năng tái tạo phát hiện mục tiêu qPCR), thiết kế và tối ưu hóa xét nghiệm (góp phần vào sự khác biệt về hiệu quả và độ nhạy của xét nghiệm) và phân tích dữ liệu (yêu cầu một số giải thích chủ quan và áp dụng các phương pháp thống kê thích hợp). Điều quan trọng là thông tin được cung cấp cho một đối tượng khoa học chứa thông tin đầy đủ cho thí nghiệm được đánh giá phê bình7, nhưng rõ ràng rằng điều này không phải lúc nào cũng là trường hợp8. Các hướng dẫn "Thông tin tối thiểu để công bố các thí nghiệm PCR thời gian thực định lượng" (MIQE) 9address những mối quan tâm này. Mục đích của các hướng dẫn MIQE là tăng tính minh bạch bằng cách chỉ định thông tin tối thiểu về xét nghiệm cần thiết cho người đọc để có thể đánh giá hiệu lực kỹ thuật của một ấn phẩm và cung cấp hướng dẫn thiết kế, tối ưu hóa và xác nhận các xét nghiệm qPCR mới.
MIQE bao gồm chín phần (thiết kế thử nghiệm, mẫu thử, axit nucleic, phiên mã ngược, mục tiêu, mồi và đầu dò, chi tiết xét nghiệm, chu trình PCR và phân tích dữ liệu; truy cập MIQE pag eto của chúng tôi để tải về danh sách kiểm tra, Bảng 1). Tất cả các thông số liên quan đến thông tin cần thu được trong quá trình thiết kế thử nghiệm, tối ưu hóa và xác thực. Khi sử dụng các xét nghiệm thương mại hoặc các xét nghiệm từ tài liệu được xuất bản, việc tối ưu hóa và xác thực vẫn phải được thực hiện. Giấy MIQE bao gồm một danh sách kiểm tra với các yếu tố được dán nhãn Essential, được coi là không thể thiếu đối với một mô tả đầy đủ về xét nghiệm qPCR, trong khi các thành phần khác được dán nhãn mong muốn, cho thấy thông tin này hữu ích nhưng ngay cả khi không có nó, xét nghiệm có thể được sao chép và dữ liệu trong ấn phẩm được đánh giá. Điều quan trọng là phải nhận ra rằng việc báo cáo hiệu quả PCR, độ nhạy phân tích và độ đặc hiệu của từng xét nghiệm là điều cần thiết và cần được xác định bởi nhà nghiên cứu sử dụng các điều kiện trong phòng thí nghiệm. Có những cân nhắc cụ thể khi thực hiện PCR kỹ thuật số (xem PCR kỹ thuật số) đã được giải quyết trong ấn phẩm PCR MIQE kỹ thuật số gần đây10.
Are You MIQE Compliant?
Thông tin tối thiểu để công bố các thí nghiệm PCR thời gian thực định lượng
AClinical Chemical Copyright 2009 by American Association for Clinical Chemistry, Inc. (bằng tiếng Anh) Được sao chép với sự cho phép của Hiệp hội Hóa học lâm sàng Hoa Kỳ, Inc. ở định dạng đăng tải Internet thông qua Trung tâm chứng nhận bản quyền.
bTất cả thông tin thiết yếu phải được gửi cùng với bản thảo, thông tin mong muốn phải được gửi nếu có. Nếu mồi đến từ RTPrimerDB, thông tin về mục tiêu qPCR, oligonucleotide, giao thức và xác nhận có sẵn từ nguồn đó.
cĐánh giá sự vắng mặt của DNA bằng cách sử dụng xét nghiệm phiên mã không có revers là điều cần thiết khi lần đầu tiên chiết xuất RNA. Một khi mẫu đã được xác nhận là DNA, tự do, việc đưa vào kiểm soát phiên mã không có revers là mong muốn nhưng không còn cần thiết nữa.
DTiết lộ trình tự đầu dò rất mong muốn và được khuyến khích mạnh mẽ. Tuy nhiên, vì tất cả các nhà cung cấp xét nghiệm được thiết kế sẵn thương mại không cung cấp thông tin này, đây không thể là một yêu cầu cần thiết. Việc sử dụng các xét nghiệm như vậy không được khuyến khích.