Immunohistochemistry

IHC 조직 준비, 항체 복원 및 전처리

일반적으로, 조직은 고정되어, 파라핀에 포매되고 IHC 분석을 위해 마이크로톰을 활용하여 절편으로 됩니다. 최초 조직 준비 후 중요한 단계는 항원 복원 필요성입니다. 고정 중 생성된 단백질 교차결합을 절단하여 숨겨진 항원을 노출하기 위해 필요합니다. 항원 에피토프(epitope)의 접근성이 여러 생물학적 요인에 따라서 크게 다양하므로, 항원 복원 및 전처리 조건은 실험적으로 결정되어야 합니다. 예를 들면, 일부 항원은 항체 결합 에피토프를 “노출”하기 위해 좀 더 적극적인 전처리가 필요하지만, 일부 항원에 대해서 전처리가 전혀 필요하지 않을 수 있습니다. 두 가지 일반적인 항원 복원 전처리 방법은 열-유도 에피토프 복원(HIER)을 포함하며, 여기에서 열원은 완충액 및 효소(단백질분해효소 K)와 함께 사용합니다. 두 번째 방법인, 단백분해-유도 에피토프 복원(PIER)은 또 다른 항원 복원 방법이며, 여기에서 단백질분해효소 K, 트립신, 키모트립신 또는 펩신과 같은 다양한 단백질분해효소가 이용될 수 있습니다.

IHC 염색 및 검출

조직 준비 및 항원 복원 전처리 후, 항체-항원 상호작용 가시화는 여러 방법으로 성취할 수 있습니다. 한 가지 일반적인 방법은 색상 발현 반응을 촉매 작용하는 양고추냉이과산화효소 또는 알칼리인산분해효소와 같은 효소에 접합되는 1차 항체를 이용합니다. 대안적으로, 면역형광(IF) 방법은 플루오르세인, 로다민 또는 Alexa Fluor와 같은 형광체에 표지된 항체를 이용합니다. 또 다른 선택사항은 표지된 2차 항체 또는 더 복잡한 검출 시스템에 의한 비간접적 항원 검출과 함께 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 것입니다. 이러한 경우, 1차 및 2차 항체 모두의 최적 역가를 각 분석에 대해 측정해야 합니다.