Alkaline Phosphatase

Alkaline Phosphatase — 분석법, 분자량, 기질 및 구조

• Bovine Alkaline Phosphatase
• 대장균 Alkaline Phosphatase
• Shrimp Alkaline Phosphatase

머크는 ELISA, Western blotting 및 조직화학적 검출을 위해 항체 및 기타 단백질 결합에 최적화된 광범위한 알칼리성 포스파타아제(ALP/ALKP) 제제를 제공합니다. BioUltra 등급 Alkaline Phosphatase는 매우 높은 특이 활동을 갖고 있어 높은 민감도가 필요한 경우 단백질 표기에 상당히 유용합니다.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)

그림 1. 안티 FLAG 항체 및 ALP 표지 2차 항체로 검출되며 BCIP/NBT 기질로 물든 FLAG-BAP 제어 단백질(ProteoQuest 색상계 웨스턴 블로팅 키트 사용, B6404)입니다.

면역 조직 화학

그림 2. SIGMAFAST™ Fast Red TR/Naphthol AS-MX Tablets(카탈로그 번호 F4523)을 기질로 사용하는 단클론 항 인체 IgA 및 항 쥐 IgG ALP 결합으로 염색된 인체 편도 조직 일부를 포르말린 고정 후 파라핀 내장 40x

당사 제품은 탈인산화된 카제인 및 다른 단백질에도 사용됩니다. ALKP는 자가결찰을 방지하기 위해 DNA 또는 RNA의 5'-말단 분해에 사용가능합니다. DNA 또는 RNA는 ALKP를 사용하여 탈인산화한 후 방사성으로 식별된 인산염(T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 통해)을 이용해 표기할 수도 있습니다.

소 알칼리성 포스파타아제

소의 장내 ALP는 이합체로서 멤브레인에서 유래한 당단백입니다.^1-3 적어도 세 개의 이성형이 존재하며 일반적으로 단량체당 질소 결합 두 개 또는 산소 결합 글리칸 한 개 이상 가지고 있습니다.² 효소는 활동을 위해 아연, 마그네슘 또는 칼슘 2가 이온을 필요로 합니다.⁴

이 효소는 알코올, 아민, 피로인산염 및 페놀의 인산염 에스테르에 대해 광범위한 특이성을 가지고 있습니다. 보통은 단백질과 핵산을 분해하는 데 사용됩니다.^5-7

K_M: 1.5 × 10^–3 M (p-니트로페닐 인산염), 19 × 10^–3 M (포스포에놀피루브산염)

분자량:^2,3 140-160 kDa (dimer MW)
E₂₇₈1 %: 7.6-10.5
등전점:^4,8,9 pI 범위 4.4-5.8에서 동질 효소

최적의 pH: 효소는 pH 범위 7.5-9.5에서 가장 안정적입니다.³ 효소 활동을 위한 최적의 pH는 pH 8-10입니다. 최적의 pH는 기질, 기질 농도, 이온 농도에 따라 변화합니다.⁸ 본 제품의 효소 활성은 pH 9.8(다이에탄올아민 버퍼 효소 분석)에서 결정됩니다.

온도는 활동성 및 안정성에 영향을 줍니다.

Inhibitors of Bovine Alkaline Phosphatase

킬레이트 시약, 비산염, 시스테인, 요오드, 무기인산, 피로인산염, 디이소프로필 인산염, 트리페닐 인산, 디이소프로필 플루오로인산 및 L-페닐알라닌이 있습니다.^9,10

Levamisole (카탈로그 번호 L9756)은 일반적으로 내생성 ALKP 활동을 억제하는 데 사용되지만 장내 효소를 아주 약간만 억제합니다.^11,12

Assay Protocols

• Diethanolamine Assay
  
• 글리신 분석 pH 8.8
• 아연을 사용하는 글리신 분석
  
• 글리신 분석 pH 10.4
  

단위 정의: DEA 단위 한 개로 37 °C, pH 9.8에서 분당 4-니트로페닐 인산염 1 µmole을 가수 분해합니다. 약 3개의 DEA 단위는 글리신 단위 한 개와 같습니다.

ALP는 또한 우유나 치즈와 같은 유제품의 저온 살균 효과를 결정하는 데 사용됩니다. ALP는 최소 15초 동안 약 72 °C의 온도에 노출될 경우 변성됩니다. 온도 조건이 덜 극단적일 경우 매개 병원체를 대부분 파괴하는 것으로 나타났습니다. 따라서 ALP 활동은 저온 살균 효과를 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 과거에는 저온 살균 후 ALP 활동을 확인하기 위해 두 가지 방법을 사용했는데, 첫 번째는 페놀을 유리시키고 측정하는 Scharer 검사였습니다. 두 번째 방법은 Aschaffenberg & Mullen 검사로 알려져 있습니다. 이 방법은 p-니트로페놀의 방출을 측정합니다. 두 가지 검사 모두에서 음성 결과는 ALP 활동이 없으며 대부분의 우유 매개 병원체가 파괴되었음을 나타냅니다. 최근에는 동일한 ALP 활동 원리를 기반으로 보다 민감한 새로운 기술이 개발되고 있습니다.

참고문헌

1. Hsu HH, Munoz PA, Barr J, Oppliger I, Morris DC, Vaananen HK, Tarkenton N, Anderson HC. 1985. Purification and partial characterization of alkaline phosphatase of matrix vesicles from fetal bovine epiphyseal cartilage. Purification by monoclonal antibody affinity chromatography. J. Biol. Chem..(260):1826-31.

2. NEUMANN H, LUSTIG A. 1980. The Activation of Alkaline Phosphatase by Effector Molecules. A Combined Kinetic and Hydrodynamic Study. Eur J Biochem. 109(2):475-480. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04818.x

3. Fosset M, Chappelet-Tordo D, Lazdunski M. 1974. Intestinal alkaline phosphatase. Physical properties and quaternary structure. Biochemistry. 13(9):1783-1788. https://doi.org/10.1021/bi00706a001

4. Besman M, Coleman JE. 1985. Isozymes of bovine intestinal alkaline phosphatase. J Biol. Chem..(260):11190-3.

5. Fernley H. 1971. 18 Mammalian Alkaline Phosphatases.417-447. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60378-9

6. Morton RK. 1955. The substrate specificity and inhibition of alkaline phosphatases of cow's milk and calf intestinal mucosa. 61(2):232-240. https://doi.org/10.1042/bj0610232

7. Morton RK. 1955. The action of purified alkaline phosphatases on di- and tri-phosphopyridine nucleotides. 61(2):240-244. https://doi.org/10.1042/bj0610240

8. Latner AL, Parsons M, Skillen AW. 1970. Isoelectric focusing of alkaline phosphatases from human kidney and calf intestine. Enzymologia. 40(1):1-7.

9. Lazdunski M, Brouillard J, Ouellet L. 1965. ÉTUDE DES EFFETS ÉLECTROSTATIQUES SUR LE MÉCANISME D'ACTION CATALYTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE INTESTINALE DE VEAU. Can. J. Chem.. 43(8):2222-2235. https://doi.org/10.1139/v65-300

10. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

11. STAGNI N, VITTUR F, DEBERNARD B. 1983. Solubility properties of alkaline phosphatase from matrix vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 761(3):246-251. https://doi.org/10.1016/0304-4165(83)90072-7

12. van Belle H. 1972. Kinetics and inhibition of alkaline phosphatases from canine tissues. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 289(1):158-168. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90118-0

13. Roger DM. 1938. Practical Experience with the Scharer Rapid Field Test for Pasteurization. Am J Public Health Nations Health. 28(11):1325-1327. https://doi.org/10.2105/ajph.28.11.1325

대장균Alkaline Phosphatase

대장균 ALKP는 주로 대장균의 원형질외극에 존재하는 것으로 추정되는 이합체, 비 글리코실레이트 단백질입니다. 최소 세 가지 이소폼(isoforms)이 존재합니다. 효소는 아연을 필요로 하며 활동을 위해 마그네슘 이온으로 더욱 활성화됩니다.^1-3 소의 효소와 같이 대장균 효소는 인산염 에스테르에 대해 광범위한 특이성을 가집니다.¹

K_M: 0.02 × 10^–3 M(p-Nitrophenyl phosphate)⁴
분자량t:² 89 kDa (Dimer MW)
E₂₇₈1%: 7.6-10.5²
등전점:⁵ pI 범위 4.5에서 동질 효소
pH 최적화: 8.0⁵

1. Reid TW, Wilson IB. 1971. 17 E. coli Alkaline Phosphatase.373-415. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60377-7

2. Anderson RA, Vallee BL. 1975. Cobalt(III), a probe of metal binding sites of Escherichia coli alkaline phosphatase.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(1):394-397. https://doi.org/10.1073/pnas.72.1.394

3. Savchenko A, Wang W, Vieille C, Zeikus J. 2001. [26] Alkaline phosphatase from Thennotoga neapolitana.298-305. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(01)31067-4

4. Boulanger RR, Kantrowitz ER. 2003. Characterization of a MonomericEscherichia coliAlkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution. J. Biol. Chem.. 278(26):23497-23501. https://doi.org/10.1074/jbc.m301105200

5. Garen A, Levinthal C. 1960. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. Coli I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. Biochimica et Biophysica Acta. 38470-483. https://doi.org/10.1016/0006-3002(60)91282-8

Shrimp Alkaline Phosphatase

새우 ALKP는 SDS-PAGE에 의해 결정된 분자량이 약 58 kDa인 이합체 단백질입니다.

새우 효소는 다른 효소의 원천보다 낮은 온도에서 변성하므로 반응 후 열불활성화 단계가 필요할 때 DNA와 RNA의 탈인산화에 권장합니다.