단백질 질량 분광법
단백질 질량 분광법은 생체표지자 발견, 단백질체학 연구, 임상 응용을 위한 생물학적 샘플을 분석하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 대규모 특성화에 사용되는 다른 기법과 비교하여, 질량 분광법은 복잡한 분석에 대한 순응성에 기반한 단백질체학의 주요 분석법이 되었습니다.
질량 분광법은 단백질의 구조, 번역 후 변경, 상호작용에 기반하여 정량적으로 단백질을 식별하고 특성화하기 위해 사용됩니다.
- 단백질 식별은 일반적으로 단백질을 펩타이드로 변환하는 화학적 또는 효소성 분해를 포함하며, 이는 질량 분광법에 의해 분석되고 전산적 방법 또는 염기서열로 식별됩니다.
- 번역 후 변형은 아미노산 잔기 질량의 변경을 통해 확인될 수 있습니다. 변형 부위는 서열분석 또는 전산적 방법으로 매핑할 수 있습니다.
- 글리칸 분석과 프로파일링을 위한, 효소 또는 화학적 방법은 당단백질로부터 글리칸 부분을 방출하기 위해 사용되며, 질량 스펙 분석을 위해 방출된 글리칸을 유도체화합니다.
- 단백질 상호작용은 특정 표적 단백질과 상호작용하는 단백질의 친화성 공동 정제에 의해 결정되거나 질량분석에 의한 분석 전 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 더 광범위하게 연구되었습니다.
관련 기술 문서
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관련 프로토콜
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정량적 단백질체학의 경우 단백질 또는 펩타이드는 직렬 질량 태그(TMT)와 iTRAQ를 사용하여 화학적으로 안정 동위원소로 표지하거나 표지된 아미노산(SILAC)의 통합을 통해 대사적으로 표지가 부착될 수 있습니다. 중량 동위원소와 경량 동위원소 통합의 비교는 질량 규격 피크 강도를 단백질 함량과 비교하여 상대적을 정량화를 할 수 있습니다. 절대 정량화를 위해 샘플은 동위원소로 표지된 합성 펩타이드 또는 선택된 반응 모니터링(SRM) 분석용 단백질 표준물 표지될 수 있습니다.
단백질 질량 분광법에서 다른 단백질과 펩타이드의 질량은 기체 상 이온의 m/z(질량 대 전하) 비율을 측정하여 결정합니다. 질량 분광법은 먼저 이온원을 사용하여 단백질 분자를 기체상 이온으로 변환시킵니다. 그 다음 질량 분광법은 m/z 비를 기준으로 이온화된 분석물질을 분리합니다. 이어 검출기는 각 m/z 값에서 이온 수를 기록합니다. MALDI와 전기분무 이온화(ESI)는 펩타이드 또는 단백질을 이온화하도록 일반적으로 사용됩니다.
MALDI-TOF 질량 분광법
MALDI는 레이저 에너지 흡수 매트릭스를 사용하여 단백질 분자의 최소 절편으로 이온을 생성하는 이온화 방법입니다. 샘플은 먼저 적절한 매트릭스 재료와 혼합됩니다. 다음으로 펄스 레이저가 샘플에 방사선을 조사하여 샘플과 매트릭스 재료의 절제 및 탈착을 촉발합니다. 분석물질 분자는 질량 분광법에 의한 분석에 앞서 수축된 기체의 양성자화 또는 탈양성자화에 의해 이온화됩니다.
전기분무 이온화 질량 분광법
전기분무 이온화(ESI)는 액체 샘플에 고전압을 통과시켜 에어로졸을 생성하는 전기분무를 사용하여 펩타이드와 단백질의 최소 절편화를 통해 이온을 생성합니다. 전기분무 이온화는 액체크로마토그래피(LC-MS)에 질량 분석기를 결합할 때 일반적으로 사용되며, 액체크로마토그래피 용출액은 직렬 처리를 위해 전기분무기에 직접 공급될 수 있기 때문입니다.
워크플로
분해 및 표지법
트립신과 같은 부위 특이적 프로테아제는 실험 스펙트럼을 단백질 데이터베이스의 이론적 스펙트럼에 일치시키거나 실행 표준과 비교함으로써 식별이 가능하도록 단백질을 작은 절편으로 나누도록 필요합니다. 세포 배양은 상대적 정량화를 위해 아미노산 공급을 통해 통합된 안정 동위원소를 사용하여 대사적으로 표지되거나 화학적인 방법으로 안정된 동위원소를 표지할 수 있습니다. 동위원소가 표지된 합성 펩타이드가 있는 스파이킹 샘플은 선택된 반응 모니터링(SRM) 분석을 통해 절대 정량화를 할 수 있습니다.
단백질 질량 분광법 보정 및 표준화
보정 표준물은 샘플 분석을 위한 제어기 역할을 할 수 있으며 단백질 정체성, 실험 민감도, 분해 효율성 측정을 위해 사용될 수 있고, 크로마토그래피 분리, 정량 분석에서 도움이 될 수 있습니다.
I크로마토그래피 분리
크로마토그래피는 분석을 위해 단백질과 펩타이드를 더 다루기 쉬운 샘플로 분리할 수 있게 해줍니다. 여러 개의 펩타이드가 유사한 질량을 가질 수 있기 때문에 HPLC는 일반적으로 질량 분석법과 매우 유사하거나 동일한 질량을 가진 펩타이드의 동시 추가를 방지하여 측정에 대한 전반적인 동적 범위를 증가시키는 데 사용됩니다.
검출 및 분석
단백질과 펩타이드는 검출 및 분석 전에 MALDI 또는 ESI에 의해 이온화됩니다. 질량 분광법은 m/z 값을 기준으로 이온을 구분합니다. 절편화 패턴 결과를 식별에 사용할 수 있으며, 동위원소 표지로 구별되거나 표지된 내부 표준물을 이용해 SRM 분석으로 정량화된 샘플의 피크 강도 비율을 평가하여 샘플을 상대적으로 정량화할 수 있습니다.
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