Amicon^® Ultra 필터를 이용한 항체 표지 반응의 정화

표준 Amicon^® Ultra 원심분리 필터를 사용하여 투석 여과를 여러 번 수행하면 항체 표지 반응에서 시료 희석 없이 미결합 표지를 효율적으로 제거할 수 있습니다. 아래의 프로토콜을 통해 원심분리 ultrafiltration 장치를 사용하여 미반응 형광 표지를 제거할 수 있습니다.

항체 접합 반응에서 미반응 형광 표지의 제거

1. 1mg의 형광 표지된 항체 용액을 2mL로 준비하여 각각 두 개의 Amicon^® Ultra-4mL 10kDa MWCO 장치에 넣고 4,000xg에서 10분 동안 원심분리합니다.
2. 물을 사용하여 잔류물(각각 약 50μL)을 2mL로 재희석하고 다시 원심분리를 합니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
3. 각 원심분리 후에, SDS-PAGE 분석과 UV-Vis 분광법을 이용한 정량화를 위해 잔류물과 여과액 시료를 저장합니다.

결과

그림 1. 투석 여과 주기를 4회 수행하기 전과 후에 FITC가 표지된 BSA의 SDS-PAGE 겔을 보여줍니다. 미결합 FITC는 출발 물질 및 첫 번째 여과액에서 보입니다. 유리 표지의 대부분은 1회의 ultrafiltration 주기 후에 제거되었습니다. 유리 FITC는 뒤따른 여과 주기 후에 사실상 검출되지 않습니다. 그림 2의 형광 측정 데이터가 이 결과를 입증합니다.

그림 2. 유리 FITC 신호는 첫 번째 ultrafiltration 후에 약 80% 감소되었으며, 뒤이은 여과 주기 후에 추가로 98%까지 감소되었습니다. 이는 단백질 표지 반응의 정화를 위한 겔 여과의 대체제로서 ultrafiltration의 가능성을 입증합니다.