RT-qPCR – PCR การถอดความแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ

RT-qPCR หรือ PCR การถอดสคริปต์ย้อนกลับเชิงปริมาณจะรวมผลของการถอดสคริปต์ย้อนกลับและ PCR เชิงปริมาณหรือ PCR แบบเรียลไทม์เพื่อขยายและตรวจจับเป้าหมายเฉพาะ RT-qPCR มีแอปพลิเคชันที่หลากหลายรวมถึงการหาปริมาณระดับการแสดงออกของยีนการตรวจสอบการรบกวน RNA (RNAi)  และการตรวจจับเชื้อโรคเช่นไวรัส วิธีการทั่วไปในการสร้างสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้ในการวัดปริมาณดีเอ็นเอในเทคนิคนี้คือการใช้โ พรบไฮโดรไลซิสเช่นโพรบ TaqMan ® หรือสีย้อมติดดีเอ็นเอสองชั้นเช่น สีย้อมสีเขียว SYBR ®

RT-qPCR คืออะไร

PCR การถอดความแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR) เกี่ยวข้องกับการตรวจจับและการวัดปริมาณของ RNA กระบวนการนี้จะดำเนินการโดยการถอดสคริปต์ RNA หรือ mRNA ทั้งหมดกลับไปยัง DNA (cDNA) ที่เสริมกันโดยเอนไซม์ Reverse Transcriptase ตามด้วยการขยายและตรวจจับเป้าหมายเฉพาะของ cDNA นี้โดยใช้เทคนิคที่เรียกว่า PCR เชิงปริมาณ (QPCR) หรือ PCR แบบเรียลไทม์ ในแต่ละรอบใน PCR นี้ปริมาณของดีเอ็นเอจะถูกวัดแบบเรียลไทม์โดยใช้สารเคมีเรืองแสงที่หลากหลาย วิธีการที่พบมากที่สุดในการสร้างสัญญาณฟลูออเรสเซนต์คือการใช้โ พรบไฮโดรไลซิสเช่นโพรบ TaqMan ® หรือสีย้อมติดดีเอ็นเอสองชั้นเช่น สีย้อมสี SYBR ® Green

การเลือกเคมีฟลูออเรสเซนต์ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่างๆเช่นการประยุกต์ใช้ต้นทุนและการทดสอบว่าเป็นการทดสอบแบบ singleplex หรือ multiplex หรือไม่ สีย้อมที่มีผลผูกพันดีเอ็นเอเป็นที่ต้องการสำหรับการวิเคราะห์ singleplex ที่มีอัตราการรับส่งต่ำเนื่องจากง่ายต่อการออกแบบมีเวลาในการตั้งค่าน้อยลงและมีประสิทธิภาพมากขึ้น โพรบฟลูออเรสเซนต์มักถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์มัลติเพล็กซ์ที่มีอัตราความเร็วสูงซึ่งต้องการความจำเพาะสูงกว่า

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ qPCR โปรดดู คู่มือทางเทคนิค PCR เชิงปริมาณของเรา

การใช้ RT-qPCR

RT-qPCR มีการประยุกต์ใช้งานที่หลากหลาย เทคนิค RT-qPCR ใช้เพื่อ:

• หาปริมาณระดับการแสดงออกของยีน
• ตรวจสอบ RNAi เพื่อศึกษาการสูญเสียการทำงานของยีนที่เลือก
• ตรวจหาเชื้อโรคเช่นไวรัสเพื่อวินิจฉัยโรคติดเชื้อ
• ตรวจจับสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMOs)

RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวเทียบกับ RT-qPCR แบบสองขั้นตอน

RT-qPCR จะดำเนินการในการวิเคราะห์หนึ่งขั้นตอนหรือสองขั้นตอน สิ่งสำคัญคือต้องพิจารณาปัจจัยต่างๆเช่นต้นทุนการใช้งานและประเภทการวิเคราะห์เมื่อเลือกวิธีการ RT-qPCR ที่เหมาะสม

รูปที่ 1 ไดอะแกรมการเปรียบเทียบเวิร์กโฟลว์ RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวกับเวิร์กโฟลว์ RT-qPCR แบบสองขั้นตอน

ขั้นตอนเดียว RT-qPCR

ในขั้นตอนเดียว RT-qPCR การถอดสคริปต์ย้อนกลับหรือการสังเคราะห์ cDNA และ qPCR จะดำเนินการในหลอดเดียวโดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะลำดับสำหรับการขยายเป้าหมายเฉพาะ โดยทั่วไปแล้วจะใช้การถอดรหัสย้อนกลับแบบดัดแปลงพันธุกรรมในการวิเคราะห์แบบขั้นตอนเดียวเนื่องจากจะทนต่ออุณหภูมิที่สูงขึ้นซึ่งจำเป็นสำหรับการหลอมไพรเมอร์เฉพาะลำดับ ควรใช้การวิเคราะห์แบบขั้นตอนเดียวเมื่อทำการวัดปริมาณยีนเดียวกันซ้ำๆโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการใช้งานที่มีปริมาณการผลิตสูงและการวินิจฉัย การพิจารณาอีกอย่างเมื่อเลือกการวิเคราะห์แบบขั้นตอนเดียวคือคุณภาพและความขาดแคลนของ RNA เนื่องจาก cDNA ที่สังเคราะห์ระหว่างปฏิกิริยาไม่สามารถบันทึกแยกกันเป็นอะลิควอทได้จึงอาจต้องใช้ตัวอย่าง RNA เดิมมากขึ้นเพื่อทำการทดสอบซ้ำ

RT-qPCR แบบสองขั้นตอน

ใน RT-qPCR แบบสองขั้นตอนการถอดสคริปต์ย้อนกลับและปฏิกิริยา QPCR จะดำเนินการในหลอดแยกที่มีบัฟเฟอร์และน้ำยาแยกต่างหาก อาจใช้ไพรเมอร์ oligo-DT และ/หรือไพรเมอร์เฉพาะยีนในการวิเคราะห์แบบสองขั้นตอน การมีบัฟเฟอร์และรีเอเจนต์แยกต่างหากช่วยให้มีความยืดหยุ่นมากขึ้นในการเลือกเอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับและตัวทำปฏิกิริยา PCR พร้อมตัวเลือกเพิ่มเติมในการเพิ่มประสิทธิภาพและปรับปรุงประสิทธิภาพการขยายของแม่แบบที่ยาก cDNA ที่มีความเสถียรมากขึ้นที่สังเคราะห์ขึ้นในขั้นตอนแรกสามารถมีความเข้มข้นและ/หรือบริสุทธิ์มากขึ้นเพื่อเก็บไว้ใช้ในอนาคตหรืออาจใช้สำหรับการวัดปริมาณยีนหลายตัวจากตัวอย่างเดียวกัน

ดูข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ PCR ใน หน้าการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ของเรา

ผลิตภัณฑ์ PCR แบบขั้นตอนเดียว RT-q สำหรับการใช้งานที่มีความเร็วสูง

ผลิตภัณฑ์ RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวของเรารวมผลของ reverse transcriptase เข้ากับแอนติบอดี้ Taq-directed แบบฮ็อตสตาร์ทในส่วนผสมของปฏิกิริยา ReadyMixTM PCR ที่สะดวกสำหรับ การใช้งานที่ใช้โพรบหรือ SYBR ® Green ส่วนผสมปฏิกิริยา ReadyMixTM PCR ของเราได้รับการคิดค้นขึ้นเป็นพิเศษโดยไม่คำนึงถึงโครงสร้างรองที่ยากหรือเคมีตรวจจับเพื่อช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่เหนือกว่าในขั้นตอนที่น้อยลง

ผลิตภัณฑ์ของเราจะพอดีกับเวิร์กโฟลว์ PCR ของคุณได้อย่างง่ายดายและมีผลิตภัณฑ์ที่เชื่อถือได้มากมายสำหรับการทดลอง RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียว - คุณจะไม่เลือกผิด ค้นพบ KiCqStart^® product sand ค้นหาส่วนผสมหลัก ReadyMix ™ที่ปรับให้เหมาะกับอุปกรณ์ของคุณหรือสำรวจ  ชุดตัวเลือก JumpStart ™ SFOR ของเราที่เหมาะกับความต้องการในการทดลองของคุณ สำหรับการวัดปริมาณ RNA แบบขั้นตอนเดียวที่มีอัตราการรับส่งข้อมูลสูงและรวดเร็วโดยใช้โ พรบฟลูออโรนิกเฉพาะลำดับให้เลือก ชุดโพรบ Kapa แบบสากลที่รวดเร็ว เลือกผลิตภัณฑ์ RT-qPCR ของเราได้อย่างมั่นใจโดยไม่ลดทอนคุณภาพ

การตรวจสอบแบบขั้นตอนเดียว RT-qPCR ReadyMix ™ KiCqStart^® –  ใช้งานร่วมกับเครื่องมือ QPCR ที่สำคัญทั้งหมดได้

 รีเอเจนต์ KiCqStart ® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix ™ของเรามีกลไกการสตาร์ทร้อนที่เข้มงวดเพื่อความจำเพาะที่สูงขึ้นและมีสูตรที่ทนต่อสารยับยั้ง PCR ในตัวอย่างได้สูง ส่วนผสมหลักที่พร้อมใช้งานซึ่งมีความไวสูงเหล่านี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อความสะดวกและมีส่วนประกอบพื้นฐานที่จำเป็นทั้งหมดสำหรับ qPCR หรือ rt-qPCR เพียงเติมไพรเมอร์โพรบและน้ำของคุณเพื่อทำค็อกเทลทดสอบให้เสร็จสมบูรณ์ This product is ideal for fast or conventional qPC

เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับความเข้ากันได้ของเครื่องมือกับผลิตภัณฑ์เหล่านี้ใน  ตัว ตรวจสอบความเข้ากันได้ของเครื่องมือเต็มรูปแบบของเราค้นพบโพรบ qPCR ที่กำหนดเองของเรา

JumpStart ™ Taq ReadyMix ™ –ปรับให้เหมาะสมสำหรับเครื่องมือ qPCR ที่สำคัญทั้งหมด

ผลิตภัณฑ์ JumpStart ™ Taq ReadyMix ™ของเราสำหรับ RT-qPCR รวมข้อดีของ Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-M-V RT) และแอนติบอดี JumpStart ™ของเราที่ไม่ได้ใช้งาน Taq polymerase M-MLV RT ที่แข็งแกร่งมีความสามารถในการถอดผ่านโครงสร้างรองที่ยากแม้ในอุณหภูมิที่สูงขึ้นในขณะที่โพลิเมอร์ JumpStart ™ Taq ของเราให้ความจำเพาะและความไวมากกว่าโพลิเมอร์ Taq มาตรฐาน ผลิตภัณฑ์เหล่านี้เข้ากันได้กับทั้งเครื่องมือที่ใช้หลอดและแผ่นเช่นเดียวกับเครื่องมือที่ใช้เส้นเลือดฝอย

บันทึก 20 10% ใน RT-qPCR ReadyMix ™(QR0200)โดยใช้รหัส SGX ที่เช็คเอาท์. ใช้ได้จนถึงวันที่ 31 มกราคม 2021

โพรบ Kapa ได้อย่างรวดเร็ว - เข้ากันได้กับเทคโนโลยีที่ใช้โพรบฟลูออโรนิกทั้งหมด

ชุดทดสอบหลักของ QRT-PCR แบบขั้นตอนเดียวที่รวดเร็วของโพรบ Kapa เป็นโซลูชันที่ละเอียดอ่อนและสะดวกสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้ RNA เป็นเทมเพลต ชุดอุปกรณ์นี้ได้รับการออกแบบมาสำหรับการวัดปริมาณ RNA แบบหนึ่งขั้นตอนที่มีอัตราการไหลสูงการขี่จักรยานอย่างรวดเร็วโดยใช้โพรบฟลูออโรนิกเฉพาะลำดับ ซึ่งสามารถใช้งานร่วมกับเทคโนโลยีที่ใช้โพรบฟลูออโรนิกทั้งหมดรวมถึงโพรบวัดความสามารถ ในการเชื่อม (เช่นโพรบวัดการส่งผ่านพลังงานฟลูออเรสเซนส์เรโซแนนซ์ (FRET) โพรบวัดความสามารถในการย่อยสลาย (เช่นโพรบ TaqMan ®) และโพรบวัดความจุ (เช่นบีคอนโมเลกุล)

ชุดนี้เป็นค็อกเทลพร้อมใช้งานที่มีส่วนประกอบทั้งหมดยกเว้นไพรเมอร์โพรบและเทมเพลตสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้การขี่จักรยานอย่างรวดเร็ว ชุดประกอบด้วยโพรบ Kapa quPCR Master Mix, สีย้อมอ้างอิงต่ำ ROX High และ ROX, Kapa RT Mix และ dUTP

ABScript II One Step RT-QPCR Probe Kit –ใช้งานร่วมกับเครื่องมือ QPCR ที่สำคัญทั้งหมดได้

AbScript II Reverse Transcriptase ในชุดอุปกรณ์ให้การถอดสคริปต์ RNA ย้อนกลับที่เชื่อถือได้ หลังจากการถอดสคริปต์ย้อนกลับโพลิเมอร์ Taq polymerase รุ่นเริ่มต้นจะทำงานที่อุณหภูมิ 95°C และ AbScript II Reverse Transcriptase จะไม่ทำงานพร้อมกัน ในปฏิกิริยา PCR ตามลำดับกิจกรรม exonuclease 5 '- 3 ' ของพอลิเมอเรส Taq จะแยกโพรบไฮบริดแยกผู้รายงานออกจากดับและปล่อยสัญญาณเรืองแสง

ชุดโพรบ ABScript II One Step RT-qPCR เป็นชุดพร้อมใช้งานสำหรับการถอดสคริปต์ย้อนกลับและ qPCR ที่ใช้โพรบในหลอดเดียว รูปแบบที่ยืดหยุ่นของชุดนี้ประกอบด้วยสีย้อม ROX (อ้างอิงแบบพาสซีฟ) ความเข้มข้น 50 เท่าแยกกันสองสีซึ่งจะถูกเพิ่มตามความต้องการของเครื่องมือ qPCR เฉพาะ

For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.

ผลิตภัณฑ์ PCR แบบสองขั้นตอน RT-q เพื่อความยืดหยุ่นที่สูงขึ้น

เรามีตัวทำปฏิกิริยาทั้งหมดที่จำเป็นในการทำการถอดรหัสย้อนกลับตามด้วยการวิเคราะห์ PCR ของ cDNA ที่สังเคราะห์ขึ้นในหลอดแยกต่างหากเพื่อความยืดหยุ่นที่สูงขึ้นในการทดลองของคุณ รวมผลิตภัณฑ์ RT-qPCR แบบสองขั้นตอนของเราไว้ในเวิร์กโฟลว์ PCR ของคุณอย่างมั่นใจโดยไม่ลดทอนความยืดหยุ่น ด้วยตัวเลือกที่หลากหลายสำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ที่เชื่อถือได้ของเราคุณจะไม่เลือกผิด

ชุดสังเคราะห์ CDNA และมิกซ์

เพื่อตอบสนองความต้องการในการถอดสคริปต์ย้อนกลับของคุณเลือกจากเอนไซม์ประเภทต่างๆและตัวเลือกบรรจุภัณฑ์หลายแบบ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดเหล่านี้รวมถึงตัวทำปฏิกิริยาที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์เส้นใยแรกและมีให้เป็นชุดที่มีตัวทำปฏิกิริยาแยกต่างหากสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพหรือเป็นส่วนผสมที่สมบูรณ์สำหรับการสังเคราะห์ First Strand ที่รวดเร็วและสะดวก

RT Enzymes — Reverse Transcriptases

เลือกจากคอลเลกชันของเอนไซม์ RT ของเราและค้นหาเอนไซม์ที่เหมาะกับความซับซ้อนของใบรับรองผลการศึกษา RNA ของคุณ ผลิตภัณฑ์ของเราประกอบด้วยไวรัส Myeloblastosis Avian (AMV) และ Moloney Murine Leukemia Virus (M-ML) Reverse Transcriptases รวมถึงรุ่นที่ปรับปรุงใหม่ของเหล่านี้เพื่อความไวที่สูงขึ้น

ดูข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการแก้ไขปัญหา RT-qPCR ใน หน้าการแก้ไขปัญหา RT-PCR/RT-qPCR

qชุด PCR

ReadyMix^T Mproducts เหล่านี้มีองค์ประกอบที่จำเป็นทั้งหมดสำหรับ qPCR เพียงเพิ่มเคมีการตรวจจับฟลูออเรสเซนต์ไพรเมอร์และเทมเพลต

ตรวจสอบ qPCR

qPCR ที่ใช้การตรวจสอบจะขึ้นอยู่กับการตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR ที่ต้องการตามลำดับ  QPCR ที่ใช้โพรบจะใช้โพรบเฉพาะเป้าหมายที่ติดฉลากเรืองแสงซึ่งแตกต่างจากวิธี QPCR ที่ใช้สีเขียวของ SYBR ® ที่ตรวจจับดีเอ็นเอที่ติดสองชั้นทั้งหมดส่งผลให้ความจำเพาะและความไวเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ยังมีสีย้อมเรืองแสงที่หลากหลายเพื่อให้สามารถใช้ไพรเมอร์หลายตัวเพื่อขยายลำดับได้พร้อมกัน

SYBR^® QPCR ที่ใช้สีเขียว

SYBR^® Green I ซึ่งเป็นสีย้อมติดดีเอ็นเอเรืองแสงที่ใช้กันทั่วไปจะผูก DNA ที่ติดอยู่สองชั้นทั้งหมด ตรวจสอบการตรวจจับโดยการวัดการเพิ่มขึ้นของการเรืองแสงตลอดทั้งรอบ SYBR^® Green I มีการกระตุ้นและการปล่อยสูงสุด 494 nm และ 521 nm ตามลำดับ ความจำเพาะของ การตรวจจับ QPCR ที่ใช้ SYBR ® Green ของเราได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นอย่างมากด้วยการรวมโพลิเมอร์ Taq ที่เริ่มร้อนเช่น JumpStart ™ Taq

ดูข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ  วิดีโอสั้นๆที่ใช้ QPCR ที่ใช้สีเขียว SYBR ®

PCR RT-q ที่ใช้ไมโครอาร์นา

ค้นหาผลิตภัณฑ์การถอดสคริปต์ย้อนกลับ microRNA ที่คุณต้องการด้วย  กลุ่มผลิตภัณฑ์ MystiCq ® ของเรา

 ระบบ MystiCq ® MicroRNA RT-qPCR

 น้ำยา MystiCq ® microRNA มีเวิร์กโฟลว์ SYBR ® Green RT-qPCR ที่สมบูรณ์สำหรับการหาปริมาณนิพจน์ในสามขั้นตอน:

1. การแยกตัว
2. cDNA synthesis
3. การวัดปริมาณโดยการขยาย

ค้นพบเพิ่มเติมเกี่ยวกับ เวิร์กโฟลว์ MystiCq ® ใน  หน้าผลิตภัณฑ์ MystiCq ® ของเรา คุณลักษณะของผลิตภัณฑ์เหล่านี้:

• มากกว่า 1,400 คู่ไพรเมอร์ที่ได้รับการออกแบบและทดสอบในห้องปฏิบัติการที่ออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายเฉพาะ microRNA ที่เป็นผู้ใหญ่
• การแปลง microRNAs ทั้งหมดทำให้อ่านค่าได้เกือบไม่จำกัดจากตัวอย่างเดียว
• การเลือกผลิตภัณฑ์ที่แตกต่างกันสามรายการสำหรับการแยก microRNA

 

qการออกแบบ PCR Assay และน้ำยาสำหรับการวิจัย SARS-CoV 2

เรามุ่งมั่นที่จะให้ทรัพยากรและเครื่องมือที่เชื่อถือได้แก่นักวิจัยเพื่อสนับสนุนการต่อสู้กับโควิด 19 (SARS-CoV 2 เพื่อตอบสนองความต้องการของชุมชนในการใช้สารและโปรโตคอลเฉพาะของ SARS-CoV 2 นักวิทยาศาสตร์ของเราได้ประเมินชุด RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวที่ใช้ RNA สำหรับการตรวจจับเป้าหมาย SARS-CoV 2 สำหรับ ใช้ในการวิจัยเท่านั้น Not For Use In Diagnostic Procedures.

การออกแบบและวิธีการทดลอง

การทดลองนี้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบว่าชุด RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวของเราสามารถตรวจจับ SARS-CoV 2 ได้หรือไม่ การทดสอบได้ดำเนินการตามโปรโตคอล CDC สำหรับการตรวจจับ SARS-CoV 2 โดยใช้เทมเพลต SARS-Cov 2 RNA สังเคราะห์เจือจางเป็น 10⁵10⁴10³10²และ 10 สำเนา ตัวอย่างการทดสอบประกอบด้วยเทมเพลตตัวทำปฏิกิริยาจากแต่ละชุดดีเอ็นเอไพรเมอร์เฉพาะเป้าหมาย/ ชุดโพรบ TaqMan ® สำหรับ N1 และ N2 (N, ยีน nucleocapsid Gene) นอกจากนี้ยังมีตัวอย่าง NTC (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต) ในการวิเคราะห์แต่ละครั้ง

ตารางที่ 2 ชุดไพรเมอร์และโพรบที่ออกแบบมาสำหรับการตรวจจับเฉพาะของ SARS-CoV-1 2 (การวิเคราะห์ N1 และ N2) For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.

Test Results

A: N1 Assay

B: N2 Assay

รูปที่ 2 การวิเคราะห์การตรวจจับ SARS-CoV 2 โดยใช้ RT-PCR ReadyMix ™เชิงปริมาณ (หมายเลข Cat QR200) สำหรับเป้าหมายไพรเมอร์ N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B)

การตรวจพบ SARS-CoV-1 N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B) ใน รูปที่ 2 2 ได้รับการดำเนินการด้วยการตรวจ RT-PCR ReadyMix ™ (หมายเลข Cat. เชิงปริมาณ QR200) ใช้สังเคราะห์ SARS-CoV 2 RNA เป็นแม่แบบ การวิเคราะห์ทั้งสองแสดงให้เห็นถึงความไวในการตรวจจับ ที่ต่ำถึง 10 2 สำเนาของแม่แบบ ไม่พบการขยายด้วยตัวอย่าง NTC

A: N1 Assay

B: N2 Assay

รูปที่ 3 การตรวจสอบ SARS-CoV 2 โดยใช้ KiCqStart ® แบบขั้นตอนเดียว Probe RT-qPCR ReadyMix ™ (หมายเลข Cat KCQS07) สำหรับเป้าหมายไพรเมอร์ N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B)

การตรวจพบ SARS-CoV-1 N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B) ใน รูปที่ 2 3 ดำเนินการกับการตรวจวิเคราะห์ KiCqStart ® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix ™ (Cat. No. KCQS07) ใช้สังเคราะห์ SARS-CoV 2 RNA เป็นแม่แบบ การวิเคราะห์ทั้งสองแสดงให้เห็นถึงความไวในการตรวจจับที่ต่ำถึง 10 สำเนาของแม่แบบ ไม่พบการขยายด้วยตัวอย่าง NTC

A: N1 Assay

B: N2 Assay

รูปที่ 4 ชุดทดสอบการตรวจจับ SARS-CoV 2 ที่ใช้โพรบ Kapa ที่รวดเร็วชุดทดสอบอเนกประสงค์ QRT-PCR Master Mix (2 เท่า) (Cat. No. KK4752) สำหรับเป้าหมายไพรเมอร์ N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B)

การตรวจพบ SARS-CoV-1 N1 (กราฟ A) และการตรวจวิเคราะห์ N2 (กราฟ B) ใน รูปที่ 2 ดำเนินการโดยใช้ชุดทดสอบอเนกประสงค์ (หมายเลข Cat. ของชุดทดสอบหลัก QRT-PCR แบบ 4 ขั้นตอนอย่างรวดเร็ว (ชุดทดสอบอเนกประสงค์ 2 เท่า) ของ Kapa Probe KK4752)ใช้สังเคราะห์ SARS-CoV 2 RNA เป็นแม่แบบ การวิเคราะห์ทั้งสองแสดงให้เห็นถึงความไวในการตรวจจับ ที่ต่ำถึง 10 2 สำเนาของแม่แบบ ไม่พบการขยายด้วยตัวอย่าง NTC

A: N1 Assay

B: N2 Assay

รูปที่ 5 การวิเคราะห์การตรวจจับ SARS-CoV-1 โดยใช้ชุดโพรบ ABScript II One Step RT-QPCR (หมายเลข Cat. 2 RK20407) สำหรับเป้าหมายไพรเมอร์ N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B)

การตรวจพบ SARS-CoV-1 N1 (กราฟ A) และ N2 (กราฟ B) ใน รูปที่ 2 5 ดำเนินการโดยใช้ชุดโพรบ ABScript II One-Step RT-QPCR (หมายเลข Cat RK20407)ใช้สังเคราะห์ SARS-CoV 2 RNA เป็นแม่แบบ การวิเคราะห์ทั้งสองแสดงให้เห็นถึงความไวในการตรวจจับที่ต่ำถึง 10 สำเนาของแม่แบบ ไม่พบการขยายด้วยตัวอย่าง NTC

สรุป

ผลลัพธ์ด้านบนระบุว่าน้ำยาและชุดเครื่องมือ RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวของเราเหมาะสำหรับการตรวจจับเป้าหมาย SARS-CoV 2 ในการวิจัย SARS-CoV 2 จากข้อมูลนี้การวิเคราะห์โดยใช้ตัวทำปฏิกิริยา RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวสามารถตรวจจับได้ต่ำสุด 100 ชุดหรือในบางกรณีจะมีสำเนาแม่แบบ RNA ต่ำสุด 10 ชุด

For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.

ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่ในบทความทางเทคนิคนี้มาจากการวิจัยภายใน

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์ RT-qPCR สำหรับการตรวจหา SARS-CoV 2 โปรดไปที่ Sigma-Aldrich.com/covid19

ไตรรีเอเจนต์^® สำหรับการแยก RNA ทั้งหมด

ไตรรีเอเจนต์^® เหมาะสำหรับการแยกอาร์เอ็นเอทั้งหมดอย่างรวดเร็วประหยัดและมีประสิทธิภาพหรือการแยกอาร์เอ็นเอดีเอ็นเอและโปรตีนออกจากตัวอย่างของมนุษย์สัตว์พืชยีสต์แบคทีเรีย และต้นกำเนิดของไวรัส

ผลิตภัณฑ์นี้มีส่วนผสมของ guanidine thiocyanate และ phenol ในสารละลาย monophase ละลายดีเอ็นเออาร์เอ็นเอและโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพในการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันหรือสลายตัวอย่างเนื้อเยื่อ หลังจากเพิ่มคลอโรฟอร์มหรือ 1 โบรโม 3 คลอโรโพรเพนและการปั่นเหวี่ยงส่วนผสมจะแยกออกเป็น 3 ขั้นตอน: เฟสน้ำที่มีอาร์เอ็นเออินเตอร์เฟสที่มีดีเอ็นเอและเฟสอินทรีย์ที่มีโปรตีน จากนั้นสามารถแยกแต่ละส่วนประกอบได้หลังจากแยกเฟสแล้ว ไตรรีเอเจนต์^{® หนึ่งมล.} เพียงพอที่จะแยกอาร์เอ็นเอดีเอ็นเอและโปรตีนจากเนื้อเยื่อ 50-100 มก. 5-10 106 เซลล์หรือ 10 ซม. 2 ของพื้นผิวจานเพาะเชื้อสำหรับเซลล์ที่ปลูกในโมโนเลเยอร์

นี่เป็นหนึ่งในวิธีการที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการแยก RNA ทั้งหมดและสามารถทำให้เสร็จสมบูรณ์ได้ในเวลาเพียง 1 ชั่วโมงโดยเริ่มจากเนื้อเยื่อหรือเซลล์ใหม่ ขั้นตอนนี้มีประสิทธิภาพมากในการแยกโมเลกุล RNA ทุกประเภทจากความยาว 0.1-15 kb RNA ที่ได้จะไม่มีการปนเปื้อนดีเอ็นเอและโปรตีนเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย มันสามารถใช้สำหรับ blots เหนือ, แยก mRNA, ใน Vitr otranslation, การทดสอบการป้องกัน RNase, โคลน, และ PCR

Tri Reagent^® ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการยับยั้งไวรัสและการแยก RNA ไวรัสเพื่อตรวจหา SARS-CoV 2 โดย RT-qPCR ในการศึกษาวิจัยหลายครั้ง^{1 2 3} ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเหมาะสำหรับการแยกและจัดเก็บ MI-RNA ที่ -80⁰C เป็นระยะเวลานาน⁴ มันถูกใช้ในการสกัดของสายพันธุ์และสุนัข coronavirus RNA ที่ใช้ต่อไปในการทดสอบ RT-PCR^{5 6} นอกจากนี้ยังใช้เพื่อแยก RNA cytoplasmic จากเซลล์ Vero ที่ติดเชื้อ SARS-CoV ⁷

For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.

ข้อมูลอ้างอิง

1. Dimke H, Larsen SL, Skov MN, Larsen H, Hartmeyer GN, Moeller JB. Phenol-chloroform-based RNA purification for detection of SARS-CoV-2 by RT-qPCR: comparison with automated systems. https://doi.org/10.1101/2020.05.26.20099440

2. Alhamlan F, Alqahtani A, Bakheet D, Bohol M, Althawadi S, Mutabagani M, Almaghrabi R, Obeid D. Development and Validation of Two In-house, Low-Cost SARS-CoV-2 Detection Assays. https://doi.org/10.1101/2020.05.18.20105510

3. Toptan T, Hoehl S, Westhaus S, Bojkova D, Berger A, Rotter B, Hoffmeier K, Cinatl J, Ciesek S, Widera M. Optimized qRT-PCR Approach for the Detection of Intra- and Extra-Cellular SARS-CoV-2 RNAs. IJMS. 21(12):4396. https://doi.org/10.3390/ijms21124396

4. Mraz M, Malinova K, Mayer J, Pospisilova S. 2009. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390(1):1-4. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.09.061

5. Gunn-Moore DA, Gruffydd-Jones TJ, Harbour DA. 1998. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology. 62(3):193-205. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00210-7

6. Erles K, Toomey C, Brooks HW, Brownlie J. 2003. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology. 310(2):216-223. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00160-0

7. Darnell ME, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR. 2004. Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. Journal of Virological Methods. 121(1):85-91. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2004.06.006

* บทความนี้เป็นแบบพิมพ์ล่วงหน้าและยังไม่ได้รับการตรวจสอบจากเพื่อน รายงานการวิจัยทางการแพทย์ใหม่ที่ยังไม่ได้รับการประเมินและไม่ควรใช้เพื่อเป็นแนวทางในการปฏิบัติทางคลินิก