พื้นฐาน PCR เชิงปริมาณ
การตรวจหา PCR เชิงปริมาณ (PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณอย่างเป็นทางการ, qPCR) สร้างขึ้นจากเทคนิค PCR พื้นฐานและช่วยให้นักวิจัยสามารถประมาณปริมาณของวัสดุเริ่มต้นในตัวอย่างได้ เนื่องจากผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบว่าเป็นรายได้จากปฏิกิริยา QPCR จึงมีช่วงการวิเคราะห์แบบไดนามิกที่กว้างกว่า PCR แบบทั่วไปและแบบจุดสิ้นสุดจากสำเนาชุดเดียวไปจนถึงประมาณ 101 1 ชุดสามารถตรวจพบได้ภายในการรันครั้งเดียว PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณและการตรวจจับแอมพลิฟายเออร์ที่ตามมาจะดำเนินการในรูปแบบท่อปิดซึ่งจะช่วยลดความจำเป็นในการจัดการหลัง PCR เช่นเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสและลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามได้อย่างมาก
หลักการพื้นฐานของ qPCR จะกล่าวถึงในหน้านี้และกลไกของสารเคมีในการตรวจจับทั่วไปจะอธิบายไว้ใน PCR เชิงปริมาณและวิธีการตรวจจับ PCR แบบดิจิตอล
Basic Principles
เมื่อทำ qPCR สีย้อมของตัวรายงานฟลูออเรสเซนต์จะถูกใช้เป็นตัววัดทางอ้อมของปริมาณกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ในระหว่างรอบการขยายแต่ละรอบ การเพิ่มขึ้นของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของโมเลกุลของผลิตภัณฑ์ PCR ที่สะสมตัวแบบทวีคูณ (แอมพลิฟายเออร์) ที่เกิดขึ้นในระหว่างขั้นตอนการเกิดปฏิกิริยาซ้ำ (ดูปฏิกิริยาลูกโซ่ Polymerase) โมเลกุลของผู้รายงานจะถูกจัดประเภทเป็นสีย้อมติดสองชั้น (DDNA) สีย้อมติดกับไพรเมอร์หรือโอลิโกโนนิวคลีโอไทด์ที่ผสมสีย้อมเพิ่มเติมซึ่งเรียกว่าโพรบ (วิธีตรวจ PCR เชิงปริมาณและ Digital PCR Detection Methods)
การใช้สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA เช่น SYBR® Green I แสดงถึงรูปแบบที่ง่ายที่สุดของเคมีตรวจจับ เมื่อสารละลายมีอิสระหรือมีดีเอ็นเอเดี่ยวที่ติดอยู่เท่านั้น (single-stranded DNA หรือ ssDNA) สีย้อม SYBR Green I จะปล่อยแสงที่ความเข้มของสัญญาณต่ำ เมื่อ PCR ดำเนินไปและปริมาณของ dsDNA เพิ่มขึ้นสีย้อมจะผูกกับแอมพลิฟายเออร์มากขึ้นและความเข้มของสัญญาณจะเพิ่มขึ้น
หรือโพรบ (หรือการรวมกันของสองขึ้นอยู่กับเคมีตรวจจับ) สามารถเพิ่มระดับความจำเพาะในการตรวจจับที่เกินกว่าสีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA เนื่องจากจะเชื่อมโยงกับพื้นที่เฉพาะของเทมเพลตที่อยู่ระหว่างไพรเมอร์ รูปแบบโพรบที่ใช้กันมากที่สุดคือโพรบแบบสองฉลาก (DLP) หรือเรียกอีกอย่างว่า โพรบแบบไฮโดรไลซิสหรือโพรบแบบ TaqMan ®) DLP เป็น oligonucleotide ที่มีฉลากเรืองแสง 5 ' เช่น 6 FAM ™และ 3 ' โมเลกุลดับเช่นหนึ่งในดับเข้มเช่น BHQ®1 หรือ OQ ™ (วิธีการตรวจจับ PCR เชิงปริมาณและดิจิตอล PCR) โพรบเหล่านี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อผสมผสานกับเทมเพลตระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองและใช้ร่วมกับโพลิเมอร์ DNA ที่มีกิจกรรม exonuclease 5 ถึง 3 เมื่อ DLP มีอิสระในการแก้ปัญหาความเข้มของสัญญาณต่ำเพราะสีย้อมของผู้รายงานอยู่ใกล้กับความนุ่มนวลของดับเพลิง เนื่องจากมีการผลิตเทมเพลตมากขึ้นในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาโพรบจะเชื่อมโยงกับเทมเพลตมากขึ้นซึ่งจะถูกแยกออกจากกิจกรรม exonuclease 5 ถึง 3 ของ DNA polymerase ที่ก้าวหน้า ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเพิ่มขึ้นเมื่อสีย้อมของผู้รายงาน 5 ถูกปล่อยออกมาเป็นสารละลาย การใช้โพรบที่ติดฉลากด้วยสีย้อมของผู้รายงานที่แตกต่างกันช่วยให้สามารถตรวจจับและวัดปริมาณของชิ้นงานหลายชิ้นได้พร้อมกันในปฏิกิริยาเดียว (มัลติเพล็กซ์)
การวิ่ง QPCR โดยทั่วไปประกอบด้วยรอบการบ่มที่อุณหภูมิสลับกันซ้ำขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.1 โปรไฟล์นี้มักใช้เมื่อสีย้อมที่มีผลผูกพันกับ DsDNA, Molecular Beacons หรือ Scorpion® Probes เป็นสารเคมีตรวจจับที่เลือกสำหรับ qPCR การยืดสีรองพื้นมีประสิทธิภาพมากที่สุดที่ 72°C เนื่องจากเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการประมวลผลของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ส่วนใหญ่ ที่อุณหภูมิ 72°C โพลิเมอร์จะเกิดขึ้นในอัตราประมาณ 100 ฐานต่อวินาที อย่างไรก็ตามยังมีความสามารถในการประมวลผลที่อุณหภูมิต่ำกว่าซึ่งเพียงพอที่จะขยายแม่แบบที่สั้นกว่า โดยทั่วไปแอมพลิฟายเออร์ QPCR จะสั้นกว่า (< 200 ฐาน) เมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์ PCR ทั่วไปจึงมักใช้ส่วนขยายร่วมกับการหลอมในขั้นตอนเดียวที่ 60°C เมื่อทำงานกับ Probles ที่ติดฉลากแบบคู่ (ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.2 ขั้นตอน)
ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.1
ตัวอย่างของโปรไฟล์ QPCR มาตรฐานที่ใช้การย้อมสีที่มีผลผูกพันกับ dsDNA, Molecular Beacon หรือ การตรวจจับ Scorpions ® Probe
- การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C และตัวอย่างจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 – 10 นาที (เวลาขึ้นอยู่กับกลไกการเริ่มร้อนของเอนไซม์โพลิเมอร์) เพื่อให้แน่ใจว่าเป้าหมายที่ซับซ้อนทั้งหมด (dsDNA) จะถูกแยกออกจากกันและมีการควั่นเพียงครั้งเดียวและสามารถขยายได้
- การขี่จักรยาน:
- การลดความอิ่มตัว: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C เป็นเวลา 10 วินาทีเพื่อละลาย dsDNA ทั้งหมด
- การอบอ่อน: อุณหภูมิจะลดลงเป็น 60°C เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อส่งเสริมไพรเมอร์และโพรบ (ถ้ารวม) ที่มีผลผูกพันกับแม่แบบ
- ส่วนขยาย: การยืดตัวต่อมาเกิดขึ้นที่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น 72°C ซึ่งเหมาะสำหรับการประมวลผลโพลิเมอร์ TaqDNA ระยะเวลาของการขยายจะขึ้นอยู่กับขนาดแอมพลิฟายเออร์ (30 วินาทีต่อ 1 kb) ระยะเวลาการยืดตัวขึ้นอยู่กับความยาวที่ต้องการของแอมพลิฟายเออร์และเอนไซม์ที่ใช้ เนื่องจากแอมพลิฟายเออร์ qPCR มีขนาดสั้นจึงมักใช้เวลา 5 – 30 วินาที
- การลดความอิ่มตัว: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C เป็นเวลา 10 วินาทีเพื่อละลาย dsDNA ทั้งหมด
- ทำซ้ำ: ขั้นตอนที่ 1 – 3 จะทำซ้ำโดยปกติจะเป็นเวลา 40 รอบ
ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.2
ตัวอย่างโปรไฟล์ qPCR การขี่จักรยานสองขั้นตอนสำหรับการตรวจจับ DLP
- การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น: อุณหภูมิจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C และปฏิกิริยาจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 – 10 นาที (ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติการเริ่มต้นที่ร้อนของเอนไซม์พอลิเมอเรส)
- การขี่จักรยาน:
- การลดความอิ่มตัว: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C เป็นเวลา 10 วินาทีเพื่อละลาย dsDNA ทั้งหมด
- การหลอมและการขยาย: อุณหภูมิจะลดลงเป็น 60°C เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อส่งเสริมไพรเมอร์ที่มีผลผูกพันกับแม่แบบและการยืดตัวที่ตามมาเกิดขึ้นเนื่องจากกิจกรรมที่เพียงพอของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่อุณหภูมินี้
- ทำซ้ำ: ขั้นตอนที่ 1 – 2 จะทำซ้ำโดยปกติจะเป็นเวลา 40 รอบ
การเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์ในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาจะวัดโดยรอบความร้อน PCR แบบเรียลไทม์ เครื่องมือ PCR แบบเรียลไทม์โดยเฉพาะจะรวมการหมุนเวียนอุณหภูมิเข้ากับออปติคัลยูนิต ออปติคอลยูนิตให้แสงที่ความยาวคลื่นที่เหมาะสมเพื่อเร่งฟลูออโรฟิลและตรวจจับการปล่อยแสงที่เกิดขึ้น เครื่องมือที่ทันสมัยจำนวนมากมีหน้าจอแสดงผลที่ติดอยู่หรือจอภาพคอมพิวเตอร์ที่อยู่ใกล้เคียงซึ่งช่วยให้สามารถติดตามปฏิกิริยาได้ในขณะที่มันดำเนินไป (รูปที่ 3.1)
รูปที่ 3.1ตัวอย่างข้อมูลการวิเคราะห์ qPCR a) ขั้นตอนต่างๆของปฏิกิริยา เส้นฐาน: ความเข้มข้นเริ่มต้นของแม่แบบอยู่ในระดับต่ำดังนั้นความเข้มของการเรืองแสงจึงต่ำเกินกว่าที่จะตรวจจับได้และมีเพียงสัญญาณพื้นหลังเท่านั้นที่สามารถมองเห็นได้ เอ็กซ์โพเนนเชียล: หลังจากที่ผลผลิตเป้าหมายถึงเกณฑ์การตรวจจับแล้วแสดงเป็นเส้นเกณฑ์ขั้นต่ำสีแดงสามารถทำตามขั้นตอนของปฏิกิริยาผ่านระยะเอ็กซ์โพเนนเชียลได้ เส้นตรง: เมื่อความเข้มข้นของแม่แบบเพิ่มความเข้มข้นของ DNA พอลิเมอเรสที่มีอยู่จะลดลงและอัตราการเกิดปฏิกิริยาจะลดลง ที่ราบสูง: ปฏิกิริยาอยู่ที่ผลผลิตสูงสุด ข) ปฏิกิริยาของแต่ละบุคคลมีลักษณะตามรอบที่ฟลูออเรสเซนส์เพิ่มขึ้นเหนือเกณฑ์ซึ่งเรียกว่าวงจรควอนตัม (Cq) หากมีวัสดุเริ่มต้นมากจะสังเกตเห็นการขยายในรอบก่อนหน้านี้และ Cq จะต่ำกว่า หากวัสดุเริ่มต้นมีน้อยจะสังเกตการขยายในรอบถัดไปและ Cq สูงกว่า ความสัมพันธ์ระหว่างฟลูออเรสเซนซ์, Cq และปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่ขยายช่วยให้สามารถวัดปริมาณเทมเพลตในช่วงไดนามิกที่กว้างได้
การวัดปริมาณและการวิเคราะห์เป้าหมาย gDNA
PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณสามารถนำไปใช้กับการวิเคราะห์เป้าหมาย gDNA ได้อย่างง่ายดาย การศึกษาดังกล่าวอาจเป็น
การกำหนดจีโนไทป์/SNP การวิเคราะห์ methylation การคัดกรองลำดับการถ่ายโอนหรือการตรวจสอบการแทรกและการลบ
การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ mRNA
การใช้ qPCR ร่วมกันคือการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเช่นการเปรียบเทียบความเข้มข้นของยีนที่น่าสนใจของ mRNA ระหว่างตัวอย่างควบคุมและตัวอย่างที่ได้รับการรักษา mRNA สามารถวัดปริมาณได้ผ่านกระบวนการ RT-qPCR แบบสองขั้นตอนหรือหนึ่งขั้นตอน (ดูที่ Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCRสำหรับรายละเอียดเพิ่มเติมของปฏิกิริยา RT)
RT-qPCR สองขั้นตอน
การถอดสคริปต์ย้อนกลับและปฏิกิริยา QPCR จะดำเนินการตามลำดับในหลอดแยกต่างหาก ทั้ง RNA ทั้งหมดหรือ
โพลีน้อยกว่า (A)+ RNA ใช้เป็นวัสดุเริ่มต้นและ cDNA ผลิตโดยการยืดตัวจากไพรเมอร์ oligo-DT,
ไพรเมอร์สุ่ม, การผสมผสานของไพรเมอร์ oligo-DT/ไพรเมอร์สุ่มหรือไพรเมอร์เฉพาะยีนโดยใช้เอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับ จากนั้นจะเพิ่มอะลิควอทของปฏิกิริยานี้ลงใน qPCR
RT-qPCR ขั้นตอนเดียว
เมื่อการถอดสคริปต์ย้อนกลับและปฏิกิริยา qPCR ถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นหลอดเดียวการตั้งค่าการทดลองจะง่ายขึ้น
และมีโอกาสปนเปื้อนน้อยลงเนื่องจากไม่มีข้อกำหนดสำหรับการจัดการตัวอย่างต่อไป
การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ของ ncRNA
RT-qPCR ที่ไม่มีการเข้ารหัสส่วนใหญ่จะมีความยาวมากกว่า 100 นิวคลีโอไทด์ดังนั้นจึงสามารถตรวจจับและวัดค่าได้โดย RT-qPCR
ด้วยเทคนิคเดียวกันกับที่ใช้ในการวิเคราะห์ mRNA ในทางกลับกัน RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบสั้นเช่น RNA แบบไมโครและแบบพายเป็นความยาวของไพรเมอร์ PCR หนึ่งตัว ด้วยเหตุนี้จึงจำเป็นต้องใช้เทคนิคที่ช่วยยืด RNAs แบบสั้นเหล่านี้ก่อนที่จะดำเนินการ qPCR มีการนำสองวิธีหลักมาใช้ในระบบที่มีจำหน่ายในท้องตลาด: 1) การใช้สีรองพื้น rt stemloop และ 2 poly-a tailing ตามด้วย rt ด้วยสีรองพื้นอะแดปเตอร์ oligo-dt (รูปที่ 3.2) วิธีการทางเลือกที่พัฒนาโดย Casoldi et al. ซึ่งไม่มีในเชิงพาณิชย์ใช้การรวมของโมเลกุลอะแดปเตอร์กับ RNA ทั้งหมดในตัวอย่างและการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเป้าหมายที่ต้องการ1,2
แนวทางสเต็มลูป RT ไพรเมอร์ได้รับการพัฒนาและทำการค้าโดยไบโอซิสเต็มส์ประยุกต์ (ปัจจุบันเทคโนโลยีชีวิต/เทอร์โม) สำหรับ QPCR ที่ใช้โพรบตาม TaqMan3 ดังที่แสดงใน รูปที่ 3.2Aปลาย 5 ของไพรเมอร์ RT สามารถจับคู่ฐานกับภูมิภาคนิวคลีโอไทด์หลายตัวจากปลาย 3 ของตัวเองเพื่อสร้างก้านคู่ฐานแยกด้วยลูปที่ไม่ได้จับคู่ ทั้งหมดยกเว้นนิวคลีโอไทด์ไม่กี่ตัวสุดท้ายที่ 3 '- ปลายของไพรเมอร์ RT เป็นสากลนั่นคือพวกเขามีลำดับเดียวกันในไพรเมอร์ miRNA ทั้งหมด นิวคลีโอไทด์สองสามตัวสุดท้ายที่ขยาย 3 ' จากลำต้นจะเสริมกับปลาย 3 ' ของ miRNA เป้าหมาย การขยายตัวของไพรเมอร์ตามแม่แบบ miRNA สร้าง
cDNA ที่สามารถขยายด้วยไพรเมอร์ไปข้างหน้าเฉพาะ miRNA และไพรเมอร์ย้อนกลับสากลซึ่งเป็น
ส่วนเสริมของไพรเมอร์ RT แบบวงลำต้น 5 '
วิธีการเชิงพาณิชย์อื่นๆทั้งหมดของ miRNA qPCR รวมถึง แบรนด์ MystiCq ® ของเราใช้โพลี - A tailing เพื่อยืด miRNA ตามที่อธิบายไว้โดย Shi และ Chiang4 Poly (A) Polymerase (PAP) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ไม่ขึ้นกับเทมเพลตจะเร่งปฏิกิริยาการถ่ายโอนสารตกค้างจาก Adenosine จาก ATP ไปยังปลาย 3 ของ RNA ใดๆ ตามที่แสดงใน รูปที่ 3.2B,RT สามารถทำได้โดยใช้ไพรเมอร์ oligo-DT สีรองพื้น oligo-DT ประกอบด้วยลำดับอะแดปเตอร์ที่ระดับ 5 ซึ่งช่วยให้ qPCR ที่ตามมามีไพรเมอร์ไปข้างหน้าซึ่งเป็นส่วนเสริมของ miRNA เฉพาะและสีรองพื้นย้อนกลับที่เสริมกับลำดับอะแดปเตอร์
รูปที่ 3.2มีสองวิธีที่ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์สำหรับ RT และ qPCR ของ miRNA ก) ไพรเมอร์แบบลูปถูกใช้เพื่อปรับขั้นตอน RT หลังจากการผสมข้ามไปยังปลาย 3 ของ miRNA การขยาย PCR ผ่านลูปจะส่งผลให้เกิด miRNA และลำดับสากลที่รวมกันซึ่งยาวพอสำหรับการขยาย B) การเพิ่มหางโพลีเอไปยัง miRNA จะให้ไซต์รองพื้นสำหรับไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยระบบทางเดิน oligo-DT และลำดับรองพื้นสากล การวิจัยกรดนิวคลีอิกโดย Oxford University Press ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก Oxford University Press ในรูปแบบการนำกลับมาใช้ใหม่ในหนังสือ/หนังสืออิเล็กทรอนิกส์ผ่านศูนย์การกวาดล้างลิขสิทธิ์
ทั้งสองวิธีการเชิงพาณิชย์มีข้อดีและข้อเสีย การล่อแบบ Stem-loop ช่วยให้ RT-qPCR แบบ 2 ขั้นตอนในขณะที่วิธีการเก็บรวบรวมโพลี - เอส่วนใหญ่จำเป็นต้องมีขั้นตอนเพิ่มเติมสำหรับ RT ก่อน qPCR มีผลิตภัณฑ์ที่รวมโพลี - เอเทลิงและ RT ในปฏิกิริยาเดียวสำหรับการเทน้ำมัน PAP แบบ 2 ขั้นตอน/RT-qPCR อย่างไรก็ตามการตรวจจับอาจมีความไวน้อยลงด้วยวิธีการนี้ (ผลลัพธ์ภายในที่ยังไม่ได้เผยแพร่) ในทางกลับกันโพลี - อะเทลิงตามด้วย RT จะสร้างสระว่ายน้ำ cDNA ที่มีความเสถียรซึ่งสามารถใช้ตรวจจับ microRNA, mRNA หรือ RNA อื่นๆได้ทันทีหรือตลอดเวลาในอนาคต ด้วยการเข้าใกล้ STEM-Loop/TaqMan จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันในการตรวจจับ miRNA แต่ละตัว สามารถเพิ่มไพรเมอร์แบบ Stem-loop หลายตัวลงใน ไพรเมอร์ RT 5 และพูลเดียวกันสำหรับ miRNA หลายตัวได้จาก Life Technologies เพื่อดำเนินการ multiplex RT อย่างไรก็ตามไม่มีตัวเลือกใดที่จะช่วยให้สามารถตรวจหา miRNA ที่ค้นพบในภายหลังได้ qPCR และไม่อนุญาตให้ qPCR ตรวจจับ mRNA จาก cDNA เดียวกันได้ ระบบที่อธิบายโดย Castoldi et al1 2 เป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัวที่มันไม่ได้ให้วิธีการในการตรวจจับโมเลกุล mRNA สารตั้งต้นและ miRNA ประมวลผลอย่างเต็มที่จากตัวอย่าง RNA รวมเดียวกัน
qPCR Requirements
เครื่องมือ
เครื่องมือ QPCR จำนวนมากได้รับการออกแบบมาเพื่อรองรับการใช้งานที่หลากหลายเช่นความสามารถในการตัดกันของเครื่องมือวัดปริมาณงานสูง ABI 7900 โดยใช้การโหลดแผ่นความร้อน 384 หลุมโดยอัตโนมัติด้วย Illumina ที่ผลิตและจำหน่ายเครื่องมือ Eco ที่รองรับแผ่นความร้อน 48 หลุมเดียว ดังนั้นเครื่องมือที่เหมาะสมที่สุดจึงตรงกับความต้องการของการวิจัย เป็นที่พึงปรารถนาที่จะเลือกเครื่องมือที่มีซอฟต์แวร์ที่ใช้งานง่ายซึ่งทำหน้าที่เป็นที่ต้องการมากที่สุดและมีความยืดหยุ่นในแง่ของการส่งออกข้อมูลเพื่อให้สามารถจัดการได้ง่ายในแพคเกจซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ทางสถิติดาวน์สตรีม ซึ่งจะช่วยลดเวลาที่ต้องใช้ในการฝึกอบรมบุคลากรดังนั้นจึงสามารถเริ่มสร้างผลลัพธ์ได้ คุณสมบัติเพิ่มเติมที่จำเป็นได้แก่บล็อก PCR ที่มีความสม่ำเสมออย่างแน่นอน (ค่าเบี่ยงเบนสูงสุดสัมบูรณ์ของ 1 cq = 2 เท่าของการจำลองแบบ 96 หลุม) และระบบลำแสงที่สร้างความตื่นเต้นและตรวจจับการปล่อยแสงได้อย่างมีเหตุผลและเท่ากันมากที่สุดในช่วงความยาวคลื่นที่กว้าง ซึ่งจะช่วยให้สามารถเลือกฟลูออโรฟอรอเรสได้หลากหลายและทำให้สามารถมัลติเพล็กซิ่งได้ คุณสมบัติอื่นๆที่ต้องพิจารณาคือต้นทุนการดำเนินงานที่เกี่ยวข้องกับวัสดุสิ้นเปลืองที่เฉพาะเจาะจงเช่นหากแผ่นไมโครไทเตอร์มาตรฐานไม่ได้ใช้สำหรับปฏิกิริยาและความสะดวกในการโหลดแผ่น/ท่อที่ไม่ใช่รูปแบบมาตรฐาน
Template
ต้องมีการทำสำเนาของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายน้อยมาก (เทียบเท่ากับ gDNA หรือ cDNA) ประมาณ 100 pg เพื่อเริ่มต้น qPCR เพื่อลดการปนเปื้อนด้วยสารยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาควรเก็บจำนวนเทมเพลตเริ่มต้นไว้ที่ระดับต่ำสุดที่จำเป็นเพื่อให้ได้ปริมาณที่ถูกต้อง เมื่อวัสดุเริ่มต้นคือ RNA การออกแบบไพรเมอร์และการรักษา DNase I จะลดสัญญาณที่อาจเกิดจากการปนเปื้อน gDNA
ไพรเมอร์
ไม่ว่าจะใช้สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA หรือเคมีตรวจจับที่ใช้โพรบการออกแบบไพรเมอร์คุณภาพสูงเป็นหนึ่งในขั้นตอนก่อนการทดลองที่สำคัญที่สุดใน qPCR สำหรับการอภิปรายโดยละเอียดเกี่ยวกับการออกแบบการวิเคราะห์ PCR, qPCR, การออกแบบการวิเคราะห์ dPCR เพื่อเพิ่มความไวและความจำเพาะให้สูงสุดควรมีการดัดแปลงที่จำเป็นเช่นกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อค (เคมีตรวจจับ QPCR)
Probe(s)
เมื่อใช้โพรบเป็นกลไกการตรวจจับแอมพลิฟายเออร์จะไม่ตรวจจับไพรเมอร์ไดเมอร์และผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงแต่ควรหลีกเลี่ยงเนื่องจากสามารถลดประสิทธิภาพการตอบสนองได้ เพื่อเพิ่มความไวและความจำเพาะสูงสุดควรเลือกประเภทโพรบที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานและการปรับเปลี่ยนที่จำเป็นเช่นกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อครวมอยู่ด้วย (เคมีการตรวจจับ QPCR)
dNTPs
PCR มาตรฐานและ qPCR หลัก Mixe มี dATP, dCTP, DGTP และ dTTP อย่างไรก็ตามมีมิกซ์บางรายการที่แทนที่ dTTP ด้วย dUTP ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาก่อนหน้านี้ทำงานด้วย dUTP จะมี uracil แทน thymine ซึ่งจะทำให้เกิดความแตกแยกได้ง่ายโดย uracil-DNA-Glycosylase (UNG) ดังนั้นก่อนการบ่มเชื้อปฏิกิริยาที่ตามมากับ UNG จะช่วยป้องกันการปนเปื้อนของสารก่อโรคระหว่างปฏิกิริยา เพื่อให้มีประสิทธิภาพ PCR ทั้งหมดในห้องปฏิบัติการต้องใช้ dUTP
แมกนีเซียม
แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ reverse transcriptase, taq DNA polymerase และ taq DNA 5 ' ถึง 3 ' กิจกรรม exonuclease ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาที่มี dLPS มักจะอยู่ระหว่าง 3 – 6 มม. ส่วนผสมหลักส่วนใหญ่ประกอบด้วย MgCl2อย่างไรก็ตามบางครั้งก็จำเป็นต้องเพิ่มความเข้มข้นดังนั้นหลอด MgCl 2 บริสุทธิ์เพิ่มเติมมักจะรวมอยู่ในผลิตภัณฑ์ผสมหลัก (ดู การเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบและการตรวจสอบ) ในบางกรณี อาจต้องใช้ส่วนผสมปฏิกิริยาที่ไม่มี MgCl 2 เพื่อให้สามารถใช้ความเข้มข้นต่ำเช่นเมื่อใช้ การตรวจจับ Scorpions ® Probe
Reverse Transcriptase
เอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับที่ให้ผลผลิตสูงของ cDNA ในขณะที่รักษากิจกรรมที่อุณหภูมิสูงเป็นสิ่งสำคัญต่อความสำเร็จของ RT-qPCR ประสิทธิภาพที่อุณหภูมิสูงช่วยให้มั่นใจได้ว่าภูมิภาคของ RNA ที่มีโครงสร้างรองที่สำคัญจะไม่เสถียรและสามารถเข้าถึงได้สำหรับการผสมข้ามและการขยายในภายหลัง เมื่อทำ RTqPCR แบบขั้นตอนเดียวประสิทธิภาพที่อุณหภูมิสูงจะช่วยให้สามารถใช้ไพรเมอร์พิเศษที่มีอุณหภูมิหลอมละลายสูง(TM)ซึ่งจะเพิ่มความจำเพาะของปฏิกิริยา เมื่อทำโปรโตคอลสองขั้นตอนสิ่งสำคัญคือต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าเอนไซม์ส่งผลให้ได้ cDNA แบบเส้นตรงและสัดส่วนจาก RNA ( ดูที่ Reverse Transcriptio nfor details of RT evaluation)
ดีเอ็นเอของ Taq Polymerase
เช่นเดียวกับการเลือก transcriptase ย้อนกลับที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ RT การเลือกเอนไซม์พอลิเมอเรสที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ ปัญหาพื้นฐานของพอลิเมอเรสดีเอ็นเอ Taq ธรรมชาติคือเอนไซม์มีกิจกรรมที่เหลืออยู่ที่อุณหภูมิต่ำ การผูกสีรองพื้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงนำไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงอันเป็นผลมาจากกิจกรรมพอลิเมอเรสที่เหลืออยู่นี้ แอนติบอดีที่ถูกบล็อกหรือถูกบล็อกทางเคมีโพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq ('hot start') ช่วยแก้ไขสถานการณ์นี้โดยการป้องกันการทำงานของเอนไซม์จนกว่าขั้นตอนการลดความอิ่มตัวของอุณหภูมิสูงจะเริ่มต้นขึ้น
บัฟเฟอร์
บัฟเฟอร์หรือรีแอคชันมาสเตอร์มิกซ์โดยทั่วไปจะประกอบด้วย dNTPs, พอลิเมอเรสดีเอ็นเอ Taq, MgCl 2 และสเตบิไลเซอร์ SYBR Green I Dye, ROX ™, Fluorescein และ inert loading dyes อาจรวมอยู่ด้วย (การโหลดสีย้อมควบคุม) ขึ้นอยู่กับข้อกำหนดทางเคมีการตรวจจับเครื่องมือและปฏิกิริยา ส่วนประกอบบัฟเฟอร์ PCR และชุดกันโคลงโดยทั่วไปจะเป็นกรรมสิทธิ์ของผู้ผลิต หากซื้อแยกต่างหากจะมีความยืดหยุ่นสูงสุดเนื่องจากส่วนผสมแต่ละชนิดสามารถปรับให้เหมาะสมกับปฏิกิริยาแต่ละชนิดได้ อย่างไรก็ตามในทางกลับกันในขณะที่ซื้อส่วนผสมเข้าด้วยกันเป็นส่วนผสมหลักลดความยืดหยุ่นจะเพิ่มความสม่ำเสมอและความสะดวกสบายในการผลิตชุดในขณะที่ลดจำนวนขั้นตอนการปิเปตและดังนั้นโอกาสของข้อผิดพลาดและการปนเปื้อน
โหลดสีย้อมควบคุม
วงจรความร้อน PCR แบบเรียลไทม์บางอย่างจำเป็นต้องมีการย้อมสีเช่น ROX เพื่อรวมเข้ากับปฏิกิริยาแต่ละอย่างเพื่อควบคุมความผันแปรในระบบออปติคอลและเพื่อปรับความแตกต่างของความเข้มของสัญญาณให้เป็นปกติ ในทำนองเดียวกันวงจรความร้อนบางอย่างจำเป็นต้องมีสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เริ่มต้นเพื่อสร้างพื้นหลังเสมือนเมื่อทำงานกับการทดสอบสีย้อม SYBR Green I (ซึ่งมีพื้นหลังต่ำมาก) ซึ่งอาจมีให้ในส่วนผสมหลักหรือเป็นส่วนประกอบแยกกันเพื่อให้สามารถใช้ความเข้มข้นที่เหมาะสมได้
แนวทาง MIQE
ปัญหาหนึ่งที่ชัดเจนเกี่ยวกับการใช้ qPCR คือการสร้างตัวเลขที่สามารถตีความได้อย่างง่ายดายว่าเป็นผลลัพธ์เชิงปริมาณ อย่างไรก็ตามสิ่งนี้อาจทำให้เข้าใจผิดได้อย่างเท่าเทียมกันเนื่องจากอาจต้องมีการควบคุมคุณภาพและการวิเคราะห์เพิ่มเติมเพื่อแยกแยะความแตกต่างระหว่างสิ่งแปลกปลอมที่อาจเกิดขึ้นซึ่งเกิดจากการออกแบบการวิเคราะห์การดำเนินการหรือการวิเคราะห์ข้อมูลที่ไม่เหมาะสม การเผยแพร่ข้อมูลสำคัญที่เห็นได้ชัดโดยไม่มีการควบคุมคุณภาพที่เพียงพอได้นำไปสู่รายงานที่ดีที่สุดไม่เกี่ยวข้องทางชีวภาพหรือทางคลินิกและที่แย่ที่สุดคือไม่ถูกต้อง
แต่ละขั้นตอนของกระบวนการทดลอง qPCR ตั้งแต่การเก็บตัวอย่างไปจนถึงการวิเคราะห์ข้อมูล qPCR มีความเสี่ยงต่อความแปรปรวน6 ดังนั้นความผันแปรอาจเกิดขึ้นได้ในระหว่างการเลือกและการประมวลผลตัวอย่างการแยกกรดนิวคลีอิก (อาจส่งผลให้คุณภาพแตกต่างกันซึ่งทำให้ขาดความสามารถในการทำซ้ำของการตรวจจับเป้าหมาย qPCR) การออกแบบและการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ (มีส่วนร่วมในความแตกต่างในประสิทธิภาพและความไวในการวิเคราะห์) และการวิเคราะห์ข้อมูล (ต้องมีการตีความแบบอัตนัยและการประยุกต์ใช้วิธีการทางสถิติที่เหมาะสม) เป็นสิ่งสำคัญที่ข้อมูลที่ให้กับผู้ชมทางวิทยาศาสตร์มีข้อมูลที่เพียงพอสำหรับการทดลองที่จะได้รับการประเมินอย่างมีวิจารณญาณ 7 แต่ก็เห็นได้ชัดว่านี่ไม่ใช่กรณีที่8 เสมอไป แนวทาง“ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ” (MIQE) 9 ระบุถึงข้อกังวลเหล่านี้ วัตถุประสงค์ของแนวทาง MIQE คือการเพิ่มความโปร่งใสโดยการระบุข้อมูลขั้นต่ำเกี่ยวกับการทดสอบที่จำเป็นสำหรับผู้อ่านเพื่อให้สามารถประเมินความถูกต้องทางเทคนิคของสิ่งพิมพ์และเพื่อให้คำแนะนำสำหรับการออกแบบการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ QPCR ใหม่
MIQE ประกอบด้วยเก้าส่วน (การออกแบบการทดลอง, ตัวอย่าง, กรดนิวคลีอิก, การถอดสคริปต์ย้อนกลับ, เป้าหมาย, ไพรเมอร์และโพรบ, รายละเอียดการทดสอบ, การขี่จักรยาน PCR และการวิเคราะห์ข้อมูล ; เยี่ยมชม MIQE Pag EtO ของเราดาวน์โหลดรายการตรวจสอบ, ตารางที่ 1) พารามิเตอร์ทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับข้อมูลที่ควรได้รับในระหว่างกระบวนการของการออกแบบทดลองการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบ เมื่อใช้การวิเคราะห์เชิงพาณิชย์หรือจากเอกสารที่เผยแพร่ควรใช้การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบความถูกต้อง กระดาษ MIQE มีรายการตรวจสอบที่มีปัจจัยที่มีป้ายกำกับ Essential ซึ่งถือว่าเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้สำหรับคำอธิบายที่เพียงพอของการวิเคราะห์ qPCR ในขณะที่ส่วนประกอบอื่นๆจะมีป้ายระบุว่าข้อมูลนี้มีประโยชน์แต่แม้จะไม่มีการวิเคราะห์อาจถูกทำซ้ำและข้อมูลภายในสิ่งพิมพ์ที่ประเมิน สิ่งสำคัญคือต้องตระหนักว่าการรายงานประสิทธิภาพ PCR ความไวในการวิเคราะห์และความจำเพาะของแต่ละการวิเคราะห์เป็นสิ่งจำเป็นและผู้วิจัยควรพิจารณาโดยใช้เงื่อนไขในห้องปฏิบัติการ มีข้อควรพิจารณาเฉพาะเมื่อทำ PCR แบบดิจิตอล (ดูที่ Digital PCR)ที่ได้รับการระบุไว้ในเอกสาร MIQE PCR แบบดิจิตอลฉบับล่าสุด10
Are You MIQE Compliant?
ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ
ลิขสิทธิ์ทางเคมีคลินิก 2009 โดย American Association for Clinical Chemistry Inc. ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก American Association for Clinical Chemistry Inc. ในรูปแบบการโพสต์ทางอินเทอร์เน็ตผ่านศูนย์การกวาดล้างลิขสิทธิ์
ขข้อมูลสำคัญทั้งหมดต้องส่งพร้อมกับต้นฉบับควรส่งข้อมูลที่ต้องการหากมี หากไพรเมอร์มาจาก RTPrimerDB ข้อมูลเกี่ยวกับเป้าหมาย qPCR, oligonucleotides, โปรโตคอลและการตรวจสอบสามารถดูได้จากแหล่งดังกล่าว
คการประเมินว่าไม่มีดีเอ็นเอโดยใช้การวิเคราะห์การถอดสคริปต์แบบไม่มีการคัดกรองเป็นสิ่งสำคัญเมื่อทำการแยก RNA เป็นครั้งแรก เมื่อตัวอย่างได้รับการตรวจสอบว่าเป็นดีเอ็นเอฟรีการรวมการควบคุมการถอดสคริปต์ที่ไม่มีการตรวจสอบเป็นที่พึงปรารถนาแต่ไม่จำเป็นอีกต่อไป
dการเปิดเผยลำดับการตรวจสอบเป็นที่ต้องการอย่างมากและเป็นการส่งเสริมอย่างมาก อย่างไรก็ตามเนื่องจากผู้ให้บริการการวิเคราะห์ที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าไม่ได้ให้ข้อมูลนี้จึงไม่สามารถเป็นข้อกำหนดที่สำคัญได้ การใช้การวิเคราะห์ดังกล่าวไม่ได้รับการสนับสนุน
วัสดุ
ข้อมูลอ้างอิง
เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่
ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?