ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์
ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR)1,2 3 ได้กลายเป็นหนึ่งในเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในชีววิทยาโมเลกุล It is used in applications from basic research to high-throughput screening. แม้ว่าจะเป็นเทคนิคที่ทรงพลังแต่การใช้งานที่หลากหลายและการประยุกต์ใช้งานที่หลากหลายนั้นเกิดจากความเรียบง่ายที่เห็นได้ชัดและต้นทุนที่ค่อนข้างต่ำ เทคนิคนี้ใช้ในการขยายส่วนดีเอ็นเอเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงจากดีเอ็นเอแหล่งที่มาหรืออาร์เอ็นเอในปริมาณที่ต่ำ (หลังจากขั้นตอนการถอดสคริปต์ย้อนกลับเพื่อสร้างดีเอ็นเอเสริม (cDNA) ให้ดูที่ การถอดสคริปต์ย้อนกลับ) ข้อดีอย่างหนึ่งของ PCR คือลำดับเป้าหมายสามารถขยายได้จากสำเนาของวัสดุเริ่มต้นเพียงชุดเดียวแม้ว่าเทมเพลตจะเสื่อมสภาพและปนเปื้อนด้วยสารยับยั้งก็ตาม ตัวอย่างเช่นการศึกษาได้ดำเนินการกับดีเอ็นเอที่สกัดจาก มัมมี่อียิปต์โบราณเพื่อระบุสมาชิกของครอบครัวคิง Tutankhamun4 PCR แม้จะมีคุณสมบัติในภาพยนตร์หลักและในละครโทรทัศน์ซีรีส์อาชญากรรมส่วนใหญ่ในบางขั้นตอนใน " การสืบสวน " แม้ว่าจะค่อนข้างมากกว่าสมมติ
กระบวนการขี่จักรยาน PCR
PCR ทั่วไปประกอบด้วย:
- การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C และปฏิกิริยาจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 – 5 นาที (สูงสุด 10 นาทีขึ้นอยู่กับลักษณะของเอนไซม์และความซับซ้อนของแม่แบบ) เพื่อให้แน่ใจว่าโมเลกุลดีเอ็นเอที่ซับซ้อนสองชั้น (DSDNA) จะถูกแยกออกเป็นเส้นเดียวสำหรับการขยาย
- การขี่จักรยาน:
- denaturation: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นถึง 95°C ซึ่งละลาย (ขัดขวางพันธะไฮโดรเจนระหว่างฐานเสริม) dsDNA ทั้งหมดเป็นดีเอ็นเอเดี่ยวควั่น (ssDNA)
- การหลอม: อุณหภูมิจะลดลงประมาณ 5°C ต่ำกว่าอุณหภูมิหลอม(TM)ของไพรเมอร์ (มัก 45 – 60°C) เพื่อส่งเสริมการยึดเกาะของไพรเมอร์กับเทมเพลต
- ส่วนขยาย: อุณหภูมิจะเพิ่มขึ้นเป็น 72°C ซึ่งเหมาะสำหรับกิจกรรม DNA polymerase เพื่อให้ไพรเมอร์ที่ถูกผสมข้ามพันธุ์สามารถขยายได้
- denaturation: อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นถึง 95°C ซึ่งละลาย (ขัดขวางพันธะไฮโดรเจนระหว่างฐานเสริม) dsDNA ทั้งหมดเป็นดีเอ็นเอเดี่ยวควั่น (ssDNA)
- ทำซ้ำ: ขั้นตอนที่ 1 – 3 จะดำเนินการในลักษณะเป็นวงจรส่งผลให้การขยายตัวแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของแอมพลิฟายเออร์ (รูปที่ 2 1 และ 2.2)
PCR ประกอบด้วยรอบของการให้ความร้อนและการระบายความร้อนด้วยปฏิกิริยา แต่ละระดับอุณหภูมิจะใช้ในการควบคุมระยะที่กำหนดของปฏิกิริยาและเวลาในการบ่มจะขึ้นอยู่กับเครื่องมือแผ่นปฏิกิริยาหรือหลอดและน้ำยา สิ่งเหล่านี้ควรได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการทดลองแต่ละครั้งโดยเฉพาะอย่างยิ่งหากต้องการความไวในการตรวจจับที่เพิ่มขึ้น 5
ระยะการเปลี่ยนสภาพเริ่มต้นประกอบด้วยช่วงเวลาที่อุณหภูมิสูงซึ่งในระหว่างนั้นโครงสร้างรองของดีเอ็นเอสองสายที่ซับซ้อน (DSDNA) จะถูกละลายเพื่อกลายเป็นดีเอ็นเอเดี่ยวที่ควั่น (ssDNA) เนื่องจากดีเอ็นเออยู่ภายใต้อุณหภูมิสูงเฟสนี้จะต้องยาวพอที่จะแยกเส้นทั้งหมดเพื่อให้สามารถใช้ได้สำหรับการรองพื้นแต่ไม่นานว่าดีเอ็นเอจะได้รับความเสียหาย การเสื่อมสภาพในระหว่างขั้นตอนการลดความอิ่มตัวของสีเริ่มต้น (หรือถัดไป) หรือการลดความอิ่มตัวของสีที่ไม่สมบูรณ์ส่งผลให้ความไวในการตรวจจับลดลง 5
ในระหว่างขั้นตอนการลดความอิ่มตัวที่สั้นกว่าซึ่งเริ่มต้นการขี่จักรยาน (10 วินาทีถึง 1 นาทีที่ 95°C) เส้นดีเอ็นเอของลำดับเป้าหมายแยกออกจากกันเพื่อสร้างเส้นเดี่ยวเช่นเดียวกับในขั้นตอนการลดความอิ่มตัวเริ่มต้น จากนั้นปฏิกิริยาจะถูกระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิการหลอมรองพื้น
ขั้นตอนการอบอ่อน (30 วินาทีถึง 1 นาทีที่อุณหภูมิ 45 – 60°C) จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ที่ผูกกับลำดับเสริมในแต่ละเส้น DNA ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบให้ยึดชิ้นงานที่สนใจและพื้นที่ของลำดับที่อยู่ระหว่างชิ้นงานจะเรียกว่าแอมพลิฟายเออร์ โดยทั่วไปอุณหภูมิการหลอมอาจประมาณ 5°C ต่ำกว่าอุณหภูมิการหลอมของดีเอ็นเอเพล็กซ์แม่แบบรองพื้น
ขั้นตอนสุดท้ายคือขั้นตอนการขยาย (20 วินาทีถึง 1 นาทีที่ 72°C) ซึ่งจะดำเนินการเพื่อให้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสขยายลำดับไพรเมอร์จาก 3’ของไพรเมอร์แต่ละตัวไปจนถึงจุดสิ้นสุดของแอมพลิฟายเออร์ ส่วนขยาย 1 นาทีโดยทั่วไปเพียงพอที่จะสังเคราะห์ชิ้นส่วน PCR ได้ถึง 2 กิโลเบส (kb) ในการขยายชิ้นส่วนขนาดใหญ่ขั้นตอนการยืดตัวจะขยายที่อัตรา 1 นาทีต่อ kb ในระหว่างการขยายครั้งแรกแม่แบบจะไม่จำกัดความยาวดังนั้นแม่แบบจะถูกสังเคราะห์ให้เกินความยาวของแอมพลิฟายเออร์ ในขั้นตอนการต่อขยายที่ตามมาความยาวของแอมพลิฟายเออร์จะถูกกำหนดโดยลำดับไพรเมอร์ที่ปลายแต่ละด้าน..
รูปที่ 2.1ไดอะแกรมของกระบวนการปฏิกิริยาแต่ละอย่างใน PCR ทั่วไป
รูปที่ 2.2ใน PCR ทางทฤษฎีปริมาณของแอมพลิฟายเออร์เป้าหมายจะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบซึ่งนำไปสู่การขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของลำดับเป้าหมาย (แกน X แสดงรอบ PCR และแกน Y แสดงจำนวนโมเลกุลแอมพลิฟายเออร์ทั้งหมด)
ในช่วงเริ่มต้นของรอบที่สองเทมเพลตสองรูปแบบอยู่ในปฏิกิริยาเส้นดีเอ็นเอดั้งเดิมและเส้นดีเอ็นเอสังเคราะห์ใหม่ซึ่งประกอบด้วยลำดับไพรเมอร์ตามด้วยความยาวตัวแปรของแอมพลิฟายเออร์ที่ปลาย 3 สายดีเอ็นเอเดิมที่เหลืออยู่ซึ่งไม่ได้รับการเตรียมไว้ในรอบแรกอาจถูกจับในรอบที่สองและส่งผลให้โมเลกุลที่ประกอบด้วยไพรเมอร์และผลิตภัณฑ์เสริม โมเลกุลจากวงจรแรกที่ได้รับการล่อและขยายจะเป็นแม่แบบสำหรับไพรเมอร์ที่มีส่วนเสริมกับวัสดุสังเคราะห์ใหม่
ในรอบที่สามดีเอ็นเอของพื้นที่เป้าหมายที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ซึ่งเป็นผลมาจากรอบที่สองจะประกอบด้วยเฉพาะแอมพลิฟายเออร์เท่านั้นดังนั้นจึงกลายเป็นเทมเพลตเฉพาะ
การขี่จักรยานซ้ำอย่างต่อเนื่องส่งผลให้การขยายตัวแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของลำดับที่คัดลอก (รูปที่ 2.2) จำนวนรอบที่ต้องการจะขึ้นอยู่กับผลผลิตที่ต้องการของผลิตภัณฑ์ PCR ในทางกลับกันขึ้นอยู่กับหมายเลขสำเนาเริ่มต้นและประสิทธิภาพการขยาย เนื่องจากความเข้มข้นสัมพัทธ์ของวัสดุเริ่มต้นกับผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายต่ำอย่างไม่น่าเชื่อ (เช่น 1/5.51 1 ถ้าโมเลกุลเดี่ยวอยู่ภายใต้การขยาย 40 รอบและประสิทธิภาพ 100% ในแต่ละรอบ รูปที่ 2.1) ดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นในตอนท้ายของปฏิกิริยานั้นเกือบจะเป็นเพียงแอมพลิฟายเออร์ PCR เท่านั้น
แม้ว่า PCR ทางทฤษฎีควรจะส่งผลให้เกิดการขยายตัวแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลอย่างต่อเนื่องแต่ในที่สุดปฏิกิริยาก็ถึงระยะหยุดนิ่ง ดูเหมือนว่าจะมีผลผูกพันที่ไม่เฉพาะเจาะจงของ DNA พอลิเมอเรสกับผลิตภัณฑ์ DNA6,7 ซึ่งจะสามารถมองเห็นได้อย่างชัดเจนเมื่อใช้ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (QPCR) และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของฉลากฟลูออเรสเซนต์ (ดู PCR เชิงปริมาณ)
ในตอนท้ายของปฏิกิริยาผลิตภัณฑ์ขยายจะถูกวิเคราะห์โดยใช้เจลอิเล็กโตรโฟเรซิส ขึ้นอยู่กับปริมาณที่ผลิตและขนาดของชิ้นส่วนที่ขยายตัวผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสามารถมองเห็นได้โดยตรงโดยการย้อมสีเจลด้วย ethidium bromide (รูปที่ 2.3) หรือใช้สีย้อมที่เพิ่งแนะนำเช่น BlueView ™ 8
รูปที่ 2.3ตัวอย่างของผลิตภัณฑ์ PCR ทั่วไปที่ได้รับการแก้ไขผ่านเจล agarose ที่ย้อมด้วย ethidium bromide PCR การพิมพ์สองด้านจะถูกรันเพื่อตรวจจับชิ้นงาน 2 ชิ้นพร้อมกันโดยแต่ละชิ้นจะมีขนาดแตกต่างกัน ทั้งสองส่วนสามารถมองเห็นเป็นวงที่แตกต่างกัน (ภาพมารยาทของแมเรียน Grieβl)
องค์ประกอบการวิเคราะห์ PCR
ด้านล่างนี้คือสรุปขององค์ประกอบที่จำเป็นสำหรับ PCR ซึ่งจะอธิบายรายละเอียดเพิ่มเติมในบทเฉพาะรวมทั้งในรายละเอียดของโปรโตคอล PCR มาตรฐานที่ส่วนท้ายของคู่มือนี้ (ภาคผนวกA)
Template
มีหลายวิธีสำหรับการทำให้ RNA และ DNA บริสุทธิ์ แม้ว่าทั้งหมดนี้จะเหมาะสมแต่ก็อาจไม่เท่ากันทั้งหมด การปนเปื้อนของแม่แบบกับวัสดุอื่นๆจากแหล่งตัวอย่างอาจส่งผลให้เกิดการยับยั้ง PCR และในกรณีที่รุนแรงความล้มเหลวที่สมบูรณ์ของการวิเคราะห์ มีบางตัวอย่างที่แสดงให้เห็นว่าสารปนเปื้อนอาจส่งผลให้เกิดการเพิ่มประสิทธิภาพการตอบสนอง9,10 ดู ตัวอย่างการทำให้บริสุทธิ์และการประเมินคุณภาพ tmen สำหรับ รายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับการทำให้บริสุทธิ์ของแม่แบบและ การควบคุมคุณภาพและ Reverse Transcriptio nfor information about Reverse Transcription (RT) reactions โดยปกติแล้วจะมีการเพิ่มดีเอ็นเอ (GDNA) จีโนมิก μL 1 μ μg ลงในการวิเคราะห์ PCR 20 – 100 5 μ μL ในขณะที่ปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA จะถูกเจือจาง 1/5 ถึง 1/10 และ 10 μ m ลงในปฏิกิริยา 20 – 50 μ μL
ไพรเมอร์
โดยทั่วไปแล้วไพรเมอร์ Oligonucleotide จะมีความยาว 15 – 25 นิวคลีโอไทด์โดยมี GC 40 – 60% และ TM ที่คล้ายกันสำหรับ
สมาชิกแต่ละคนของทั้งคู่ วิธีง่ายๆในการประเมิน TM ของ oligos สั้น (<2 ฐาน) คือการใช้สูตร 2511:
TM = 4 (G + C) + 2 (A + T)
โปรดดู รายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบและการจัดการไพรเมอร์ใน PCR/qPCR/dPCR Assay Desig nfor more details on primer design and handling อุณหภูมิเริ่มต้นที่เหมาะสำหรับใช้ในการอบอ่อนประมาณ 5°C น้อยกว่าอุณหภูมิหลอม อุณหภูมิการหลอมสามารถปรับให้เหมาะสมได้โดยใช้บล็อก PCR การไล่ระดับอุณหภูมิ โปรโตคอลสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิ (ใช้ qPCR เป็นตัวอย่าง) จะแสดงใน ภาคผนวก A
DNA Polymerase
มีเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรสที่หลากหลายและเป็นสิ่งสำคัญที่เอนไซม์ที่ถูกต้องจะถูกเลือกโดยใช้คำจำกัดความของการทดลอง (ไม่ใช่แค่ความพร้อมของเอนไซม์ที่กำหนดในตู้แช่แข็งในห้องปฏิบัติการ) ตัวอย่างเช่นเอนไซม์บางชนิดได้รับการออกแบบให้ไม่ใช้งานที่อุณหภูมิต่ำและใช้ในโปรโตคอลเริ่มต้นเพื่อลดการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงในขณะที่เอนไซม์อื่นมีอัตราความผิดพลาดต่ำและถูกเลือกสำหรับการขยายของชิ้นส่วนสำหรับการโคลน
dNTPs
ความเข้มข้นของ dNTP แต่ละตัว (dATP, dCTP, DGTP, dTTP) ใน PCR มักจะเป็น 200 μM อย่างไรก็ตามความเข้มข้นของ dNTP จะต้องมากเกินไปและอาจต้องเพิ่มขึ้นเพื่อการขยายชิ้นส่วนที่ยาวหรือเป้าหมายที่มีปริมาณมาก เมื่อเร็วๆนี้มีการปรับปรุงส่วนประกอบบัฟเฟอร์ PCR เช่น CleanAmp ™ dNTPs12 เหล่านี้เป็น nucleoside triphosphates ดัดแปลงที่บล็อกการรวมตัวของ DNA polymerase nucleotide CleanAmp dNTP Sare เปิดใช้งานโดยขั้นตอนการทำความร้อนเริ่มต้นและขั้นตอนการลดความอิ่มตัวที่ตามมาในสภาพการปั่นจักรยานเริ่มต้นร้อนทั่วไป กระบวนการนี้จะจำกัดจำนวนของ dNTP ที่เปิดใช้งานในระหว่างแต่ละรอบของ PCR ซึ่งจะช่วยให้สามารถขยายผลิตภัณฑ์ที่ต้องการได้อย่างเฉพาะเจาะจงและมีประสิทธิภาพมากขึ้น ในทางกลับกันพวกเขาลดหรือหลีกเลี่ยงอย่างสมบูรณ์มิสรองพื้นหรือรองพื้นการก่อตัวของไดเมอร์และดังนั้นจึงเป็นทางเลือกหนึ่งสำหรับการเริ่มต้นดีเอ็นเอโพลิเมอร์ร้อน
ความเข้มข้น MgCl 2
ไอออน MG 2 + ฟรีเป็นปัจจัยร่วมสำหรับกิจกรรม DNA polymerase อย่างไรก็ตาม ไอออน MG 2 + สร้างคอมเพล็กซ์ด้วย dNTP, ไพรเมอร์และเทมเพลต DNA ด้วยเหตุนี้จึง ต้องเลือกความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ MgCl 2 สำหรับการทดสอบแต่ละครั้งโดยการทดสอบปฏิกิริยาที่มีความเข้มข้นแตกต่างกัน MgCl 2 ความเข้มข้นโดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 1.5 – 5.5 มม. แต่สามารถทดสอบได้ในช่วง 1 – 8 มม. ระหว่างการเพิ่ม ประสิทธิภาพ (ดูการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบและการตรวจสอบ)
Fluorescent Labels
สีย้อมเรืองแสงจะถูกรวมเข้ากับปฏิกิริยาเมื่อมีการตรวจจับแอมพลิฟายเออร์โดยตรงเช่นเมื่อมีการตั้งค่า qPCR หรือ digital PCR (dPCR) ซึ่งรวมอยู่ในบัฟเฟอร์หรือติดอยู่กับไพรเมอร์หรือโพรบเพิ่มเติม (ดูที่ วิธีการตรวจ PCR เชิงปริมาณและ Digital PCR Detection)
เครื่องมือ
แต่เดิมการทำ PCR นั้นใช้แรงงานมากเนื่องจากดำเนินการโดยการเคลื่อนย้ายท่อปฏิกิริยาระหว่างอ่างน้ำ 3 อ่างซึ่งแต่ละแห่งจะถูกตั้งค่าที่อุณหภูมิที่ต้องการสำหรับการลดความอิ่มตัวการหลอมและการยืดตัว น้ำมันถูกเพิ่มลงไปที่ด้านบนของปฏิกิริยาเพื่อป้องกันการระเหยและการวิเคราะห์เป็นเรื่องยากที่จะทำงานโดยไม่ได้รับการรบกวนจากน้ำมัน ปัจจุบันเป็นเรื่องปกติที่จะใช้หนึ่งในเครื่องมือการขี่จักรยานความร้อนเฉพาะทางที่มีจำหน่ายในท้องตลาด รูปแบบแผ่นและบล็อกแตกต่างกันระหว่าง 48 - 96 หรือ 384 หลุมและเข้ากันได้กับปิเปตหลายช่อง ส่วนใหญ่ใช้ฝาที่มีความร้อนซึ่งจะช่วยลดความจำเป็นในการซ้อนทับน้ำมัน อย่างไรก็ตามมีเครื่องมือที่มีอัตราการรับส่งสูงตามหลักการอาบน้ำน้ำเดิม13
การแก้ไข PCR เฉพาะแอปพลิเคชัน
การได้มาของ PCR ที่หลากหลายต้องมีการปรับเปลี่ยนปฏิกิริยา การปรับเปลี่ยนบางอย่างเหล่านี้สำหรับแอปพลิเคชันยอดนิยมจะรวมอยู่ที่นี่
โคลนนิ่ง
PCR สามารถใช้เพื่อขยายลำดับที่เลือกสำหรับการแทรกลงในเวกเตอร์ได้ ลำดับเหล่านี้สามารถปรับเปลี่ยนได้เพื่อรวมพื้นที่เฉพาะ (หาง) สำหรับการจำแนกเอนไซม์โคลน ไพรเมอร์ที่ถูกส่งไปยังเวกเตอร์ถูกใช้เพื่อแยกชิ้นส่วนที่ถูกโคลนเป็นเวกเตอร์แล้ว จำเป็นต้องใช้เอนไซม์ DNA พอลิเมอเรสในอัตราความผิดพลาดต่ำสำหรับขั้นตอน PCR
ไซต์แท็กลำดับ
สิ่งเหล่านี้ได้รับการออกแบบมาให้เป็นปลาย 5 ของไพรเมอร์และใช้ในระหว่างการจัดลำดับปริมาณงานสูงเมื่อต้องใช้แท็กเฉพาะเป็นตัวบ่งชี้ว่าส่วนใดส่วนหนึ่งของจีโนมตัวอย่างที่เฉพาะเจาะจงมีอยู่ในโคลนที่เลือกเพื่อให้ข้อมูลลำดับจีโนมสามารถถอดรหัสและระบุได้ ไปยังตัวอย่างต้นฉบับ
เว็บไซต์กำกับ Mutagenesis
ในการศึกษาการทำงานของโปรตีนการกลายพันธุ์ที่ต้องการอาจถูกนำมาใช้ในลำดับดีเอ็นเอ การเปลี่ยนแปลงฐานที่ต้องการได้รับการออกแบบให้เป็นไพรเมอร์ (ไปจนถึงปลายปี 5) ซึ่งมีไซต์การจำกัดเอนไซม์โคลนที่จำเป็น วิธีการทางเลือกใช้โปรโตคอลหลายขั้นตอนโดยไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงกับเป้าหมายและมีไซต์โคลนถูกใช้ร่วมกับไพรเมอร์ที่มีการกลายพันธุ์ที่ต้องการ