RT-qPCR – PCR phiên mã ngược định lượng
RT-qPCR, hoặc PCR phiên mã ngược định lượng, kết hợp tác động của phiên mã ngược và PCR định lượng hoặc PCR thời gian thực để khuếch đại và phát hiện các mục tiêu cụ thể. RT-qPCR có nhiều ứng dụng bao gồm định lượng mức độ biểu hiện gen, xác nhận can thiệp RNA (RNAi) và phát hiện mầm bệnh như virus. Các cách tiếp cận phổ biến để tạo ra tín hiệu huỳnh quang được sử dụng để đo lượng DNA trong kỹ thuật này là sử dụng đầu dò thủy phân như đầu dò TaqMan ® hoặc thuốc nhuộm liên kết DNA sợi kép như nhuộm xanh SYBR ®.
PCR RT- q là gì?
PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) liên quan đến việc phát hiện và định lượng RNA. Quá trình này được thực hiện bằng cách phiên mã ngược RNA hoặc mRNA thành DNA bổ sung (cDNA) bởi enzyme phiên mã ngược, sau đó khuếch đại và phát hiện các mục tiêu cụ thể của cDNA này bằng cách sử dụng một kỹ thuật gọi là PCR định lượng (quantitative PCR) hoặc PCR thời gian thực. Ở mỗi chu kỳ trong PCR này, lượng DNA được đo trong thời gian thực bằng cách sử dụng nhiều loại hóa học huỳnh quang. Các cách tiếp cận phổ biến nhất để tạo ra tín hiệu huỳnh quang là sử dụng đầu dò thủy phân như đầu dò TaqMan ®, hoặc thuốc nhuộm liên kết DNA sợi kép như nhuộm xanh SYBR ®.
Việc lựa chọn hóa học huỳnh quang phụ thuộc vào các yếu tố như ứng dụng, chi phí và liệu xét nghiệm là xét nghiệm đơn hay xét nghiệm đa nhân. Thuốc nhuộm liên kết DNA được ưa thích cho các xét nghiệm đơn giao, thông lượng thấp vì chúng dễ thiết kế hơn, có thời gian thiết lập ít hơn và tiết kiệm chi phí hơn. Các đầu dò huỳnh quang thường được sử dụng trong các xét nghiệm đa chiều, thông lượng cao đòi hỏi độ đặc hiệu cao hơn.
Để biết thêm thông tin về qPCR, hãy xem Hướng dẫn kỹ thuật PCR định lượng của chúng tôi
Ứng dụng củaPCR RT- q
RT-qPCR có nhiều ứng dụng khác nhau. Kỹ thuật RT-qPCR được sử dụng để:
- định lượng mức độ biểu hiện gen
- Xác nhận RNAi để nghiên cứu sự mất chức năng của các gen chọn lọc
- phát hiện các mầm bệnh như virus để chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm
- Phát hiện các sinh vật biến đổi gen (GMO)
RT-q PCR một bước so với RT-qPCR hai bước
RT-qPCR được thực hiện trong xét nghiệm một bước hoặc hai bước. Điều quan trọng là phải xem xét các yếu tố khác nhau như chi phí, ứng dụng và loại xét nghiệm khi chọn đúng loại phương pháp RT-qPCR.
Hình 1.Sơ đồ so sánh quy trình RT-qPCR một bước so với quy trình RT-qPCR hai bước.
RT-qPCR một
bước trong RT-qPCR một bước, phiên mã ngược hoặc tổng hợp cDNA và qPCR được thực hiện trong một ống duy nhất bằng cách sử dụng các mồi riêng theo trình tự để khuếch đại một mục tiêu cụ thể. Các phiên mã ngược biến đổi gen thường được sử dụng trong các thử nghiệm một bước vì chúng chịu được nhiệt độ cao hơn cần thiết để ủ các mồi cụ thể theo trình tự. Một xét nghiệm một bước được ưu tiên khi việc định lượng lặp đi lặp lại cùng một gen được thực hiện, đặc biệt là trong các ứng dụng thông lượng cao và chẩn đoán. Một sự cân nhắc khác khi chọn xét nghiệm một bước là chất lượng và sự khan hiếm của RNA. Vì cDNA được tổng hợp trong quá trình phản ứng không thể được lưu riêng như một phân lượng, nên có thể cần nhiều mẫu RNA ban đầu để lặp lại xét nghiệm.
Hai bước RT-qPCR
trong hai bước RT-qPCR, phiên mã ngược và phản ứng qPCR được thực hiện trong các ống riêng biệt có bộ đệm và thuốc thử riêng biệt. Các hexamers ngẫu nhiên, oligo-DT primers, và / hoặc gen đặc hiệu primers có thể được sử dụng trong các thử nghiệm hai bước. Có bộ đệm và thuốc thử riêng biệt cho phép linh hoạt hơn trong việc lựa chọn các enzyme phiên mã ngược và thuốc thử PCR, với nhiều lựa chọn hơn để tối ưu hóa và cải thiện hiệu quả khuếch đại của các mẫu khó. CDNA ổn định hơn được tổng hợp trong bước đầu tiên có thể được tập trung hơn và / hoặc tinh chế để được lưu trữ để sử dụng trong tương lai hoặc nó có thể được sử dụng để định lượng nhiều gen từ cùng một mẫu.
Tìm hiểu thêm về tối ưu hóa xét nghiệm PCR trong trang Tối ưu hóa và Xác thực xét nghiệm của chúng tôi
Sản phẩm PCR RT- q một bước dành cho các ứng dụng thông lượng cao
Các sản phẩm RT-qPCR một bước của chúng tôi kết hợp hiệu quả của phiên mã ngược với kháng thể hướng Taq khởi động nóng trong hỗn hợp phản ứng PCR ReadyMixTM thuận tiện cho các ứng dụng dựa trên đầu dò hoặc SYBR ® Green. Bất kể cấu trúc thứ cấp khó khăn hay hóa học phát hiện, các hỗn hợp phản ứng ReadyMixTM PCR của chúng tôi được chế tạo đặc biệt để giúp đạt được kết quả vượt trội trong ít bước hơn.
Sản phẩm của chúng tôi sẽ dễ dàng phù hợp với quy trình PCR của bạn và với nhiều sản phẩm đáng tin cậy khác nhau cho các thí nghiệm RT-qPCR một bước – bạn sẽ không đưa ra lựa chọn sai. Khám phá cát sản phẩm KiCqStart ® Tìm hỗn hợp ReadyMix™ chính được tối ưu hóa cho thiết bị của bạn hoặc khám phá bộ sản phẩm sov jumpstart™ của chúng tôi có thể tối ưu hóa theo nhu cầu thử nghiệm của bạn. Đối với thông lượng cao, chu kỳ nhanh, định lượng RNA một bước bằng cách sử dụng các đầu dò fluorogenic cụ thể theo trình tự chọn bộ phổ quát NHANH CỦA ĐẦU DÒ KAPA. Tự tin chọn bất kỳ sản phẩm RT-qPCR nào của chúng tôi mà không ảnh hưởng đến chất lượng.
Probe RT-qPCR ReadyMix™ KiCqStart® một bước – tương thích với tất cả các thiết bị qPCR chính
Thuốc thử nghiệm ReadyMix™ của KiCqStart ® một bước của chúng tôi có cơ chế khởi động nóng nghiêm ngặt cho độ đặc hiệu lớn hơn và được xây dựng để chịu đựng cao các chất ức chế PCR trong mẫu. Các hỗn hợp chính có độ nhạy cao có thể sử dụng được thiết kế để mang lại sự thuận tiện và chứa tất cả các thành phần cơ bản cần thiết cho qPCR hoặc RT-qPCR. Chỉ cần thêm mồi, đầu dò và nước để hoàn thành cốc-tai xét nghiệm. This product is ideal for fast or conventional qPC
Tìm hiểu thêm về khả năng tương thích thiết bị với các sản phẩm này trong Bộ kiểm tra Tương thích Toàn bộ Thiết bị của chúng tôi khám phá các đầu dò qPCR tùy chỉnh của chúng tôi.
Jumpstart™ Taq ReadyMix ™ – Có thể tối ưu hóa cho tất cả các thiết bị qPCR chính
Các sản phẩm jumpstart™ Taq ReadyMix™ của chúng tôi cho RT-qPCR kết hợp những ưu điểm của virus bệnh bạch cầu Moloney Murine Reverse Transcriptase (M-MLV RT) và kháng thể Taq polymerase bất hoạt kháng thể jumpstart™ của chúng tôi. M-MLV RT mạnh mẽ có khả năng sao chép thông qua các cấu trúc thứ cấp khó khăn, ngay cả ở nhiệt độ cao trong khi jumpstart™ Taq polymerase của chúng tôi cung cấp độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn so với Taq polymerase tiêu chuẩn. Những sản phẩm này tương thích với cả dụng cụ dựa trên ống và tấm cũng như dụng cụ dựa trên mao dẫn.
Tiết kiệm 20% trên RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200) bằng cách sử dụng mã SGX khi thanh toán. Có hiệu lực đến ngày 31 tháng 1 năm 2021.
ĐẦU DÒ KAPA NHANH – tương thích với tất cả các công nghệ dựa trên đầu dò huỳnh quang
Bộ công cụ Universal Mix Universal Mix FAST qRT-PCR Master Mix NHANH của ĐẦU DÒ KAPA là một giải pháp nhạy cảm và thuận tiện cho PCR thời gian thực sử dụng RNA làm mẫu. Bộ được thiết kế để định lượng RNA một bước, thông lượng cao, chu kỳ nhanh bằng cách sử dụng các đầu dò fluorogenic cụ thể theo trình tự. Nó tương thích với tất cả các công nghệ dựa trên đầu dò fluorogenic, bao gồm các đầu dò lai (ví dụ, đầu dò chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET))), đầu dò thủy phân (ví dụ, đầu dò TaqMan ®) và đầu dò dịch chuyển (ví dụ, đèn hiệu phân tử).
Bộ này là một loại cocktail sẵn sàng sử dụng có chứa tất cả các thành phần ngoại trừ mồi, đầu dò và khuôn mẫu cho PCR thời gian thực dựa trên đầu dò, đạp xe nhanh. Bộ này chứa thuốc nhuộm tham chiếu thấp ROX ĐẦU DÒ KAPA, hỗn hợp qPCR Master Mix NHANH, ROX High và ROX Low Reference, KAPA RT Mix, và dUTP.
Bộ Probe ABScript II Một Bước RT-qPCR – Tương thích với tất cả các thiết bị qPCR chính
Phiên mã ngược ABScript II trong bộ cung cấp phiên mã ngược đáng tin cậy của RNA. Sau khi phiên mã ngược, phiên bản khởi động nóng của Taq polymerase được kích hoạt ở 95 °C và phiên mã ngược ABScript II bị bất hoạt đồng thời. Trong phản ứng PCR tuần tự, hoạt động exonuclease 5′-3′ của Taq polymerase tách đầu dò lai, tách phóng viên ra khỏi máy quencher và giải phóng một tín hiệu huỳnh quang.
Bộ dụng cụ thử nghiệm ABScript II One Step RT-qPCR là một bộ sẵn sàng để sử dụng cho phiên mã ngược và qPCR dựa trên đầu dò tiếp theo trong một ống duy nhất. Định dạng linh hoạt của bộ công cụ này bao gồm hai nồng độ thuốc nhuộm ROX (tham chiếu thụ động) 50X riêng biệt, được thêm vào theo yêu cầu của các thiết bị qPCR cụ thể.
For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.
Sản phẩm PCR RT- q hai bước cho độ linh hoạt cao hơn
Chúng tôi cung cấp tất cả các thuốc thử cần thiết để thực hiện phiên mã ngược, sau đó là phân tích PCR của cDNA tổng hợp trong các ống riêng biệt để có độ linh hoạt cao hơn trong các thí nghiệm của bạn. Tự tin kết hợp các sản phẩm RT-qPCR hai bước của chúng tôi vào quy trình PCR của bạn mà không ảnh hưởng đến tính linh hoạt. Với nhiều lựa chọn khác nhau cho các sản phẩm PCR đáng tin cậy của chúng tôi, bạn sẽ không đưa ra lựa chọn sai.
CDNA Synthesis Kitits and Mixes
Để đáp ứng nhu cầu phiên mã ngược của bạn, hãy chọn trong số các loại enzyme khác nhau và một số tùy chọn đóng gói. Tất cả các sản phẩm này bao gồm các thuốc thử cần thiết cho quá trình tổng hợp chuỗi đầu tiên và có sẵn dưới dạng bộ với các thuốc thử riêng biệt để tối ưu hóa hoặc dưới dạng hỗn hợp hoàn chỉnh để tổng hợp First-Strand nhanh chóng và thuận tiện.
Enzyme RT - Phiên mã ngược
chọn từ bộ sưu tập các enzyme RT của chúng tôi và tìm ra một enzyme phù hợp với độ phức tạp của phiên mã RNA của bạn. Các sản phẩm của chúng tôi bao gồm virus Myelobastosis tiêu chuẩn (AMV) và virus bệnh bạch cầu ở chuột Moloney (M-MLV) cũng như các phiên bản nâng cao của những virus này để có độ nhạy cao hơn.
Tìm hiểu thêm về khắc phục sự cố RT-qPCR trong trang Khắc phục sự cố RT-PCR / RT-qPCR.
qPCR Kits
Các sản phẩm ReadyMix T này chứa tất cả các thành phần cần thiết cho qPCR. Chỉ cần thêm hóa học phát hiện huỳnh quang, mồi và mẫu.
QPCR dựa trên đầu dò
QPCR dựa trên đầu dò dựa trên phát hiện cụ thể theo trình tự của sản phẩm PCR mong muốn. Không giống như các phương pháp qPCR dựa trên SYBR ® Green phát hiện tất cả DNA sợi kép, qPCR dựa trên đầu dò sử dụng đầu dò đích cụ thể được dán nhãn huỳnh quang dẫn đến độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn. Ngoài ra, một loạt các thuốc nhuộm huỳnh quang có sẵn để nhiều mồi có thể được sử dụng để đồng thời khuếch đại nhiều chuỗi.
QPCR dựa trên xanh SYBR ®
SYBR® Green I, một loại thuốc nhuộm liên kết DNA huỳnh quang phổ biến, liên kết tất cả DNA sợi kép. Việc phát hiện được theo dõi bằng cách đo sự gia tăng huỳnh quang trong suốt chu kỳ. SYBR® Green I có kích thích và phát xạ tối đa lần lượt là 494 nm và 521 nm. Độ đặc hiệu của khả năng phát hiện qPCR dựa trên SYBR ® Green của chúng tôi được tăng cường đáng kể nhờ sự kết hợp của một loại thuốc Taq polymerase trung gian khởi động nóng, như jumpstart™ Taq.
Khám phá thêm về video ngắn này dựa trên SYBR ® Green qPCR i trong video ngắn này.
PCR dựa trên microRNA RT- q
Tìm các sản phẩm phiên mã ngược microRNA mà bạn cần với dòng sản phẩm MystiCq ® của chúng tôi.
MystiCq® microRNA RT-qPCR SystemR
Thuốc thử microRNA MystiCq ® cung cấp quy trình SYBR® Green RT-qPCR hoàn chỉnh để định lượng biểu thức chỉ trong ba bước:
- Cô lập
- cDNA synthesis
- Định lượng bằng khuếch đại
Tìm hiểu thêm về quy trình công việc MystiCq ® trong trang sản phẩm MystiCq ® của chúng tôi. Những sản phẩm này có tính năng:
- Hơn 1.400 cặp mồi được thử nghiệm trong phòng thí nghiệm ướt và thiết kế sẵn được thiết kế để chỉ nhắm mục tiêu các microRNA trưởng thành
- Chuyển đổi tất cả các microRNA, cho phép đọc gần như không giới hạn từ một mẫu duy nhất
- Lựa chọn ba sản phẩm khác nhau để phân lập microRNA
qPCR thiết kế và thuốc thử cho nghiên cứu SARS-CoV-2
Chúng tôi cam kết cung cấp cho các nhà nghiên cứu các nguồn lực và công cụ đáng tin cậy để hỗ trợ cuộc chiến chống lại COVID-19 (SARS-CoV-2). Để đáp ứng nhu cầu của cộng đồng về thuốc thử và giao thức đặc hiệu SARS-CoV-2, các nhà khoa học của chúng tôi đã đánh giá bộ RT-qPCR một bước dựa trên RNA để phát hiện mục tiêu SARS-CoV-2. Chỉ dành cho nghiên cứu sử dụng. Not For Use In Diagnostic Procedures.
Thiết kế và phương pháp thử nghiệm
Thí nghiệm này được tiến hành để xác định xem bộ công cụ RT-qPCR một bước của chúng tôi có thể phát hiện SARS-CoV-2 hay không. Xét nghiệm được thực hiện theo giao thức CDC để phát hiện SARS-CoV-2 bằng cách sử dụng RNA SARS-CoV-2 tổng hợp làm mẫu, pha loãng thành 105, 10 4, 10 3, 10 2 và 10 bản sao. Mẫu thử nghiệm chứa mẫu, thuốc thử từ mỗi bộ, bộ mồi DNA cụ thể của mục tiêu / bộ đầu dò TaqMan ® cho N1 và N2 (N, gen nucleocapsid). Các mẫu NTC (không kiểm soát mẫu) cũng được bao gồm trong mỗi xét nghiệm.
Bảng 2. Bộ mồi và đầu dò được thiết kế để phát hiện cụ thể SARS-CoV-2 (xét nghiệm N1 và N2). For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.
Test Results
A: N1 Assay
B: N2 Assay
Hình 2.Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 sử dụng RT-PCR ReadyMix™ định lượng (Cat. No. QR200) cho mục tiêu mồi N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B).
Các N1 xét nghiệm SARS-CoV-2 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B) trong Hình 2 đã được thực hiện với định lượng RT-PCR ReadyMix™ (Cat. No. QR200) sử dụng RNA SARS-CoV-2 tổng hợp làm khuôn mẫu. Cả hai xét nghiệm đều cho thấy độ nhạy cảm để phát hiện ra mức thấp nhất là 10 2copies mẫu. Không quan sát thấy khuếch đại với các mẫu NTC
A: N1 Assay
B: N2 Assay
Hình 3.Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 sử dụng Máy dò một bước RT-qPCR ReadyMix™ của KiCqStart® (Số Cat. KCQS07) cho mục tiêu mồi N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B).
Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B) trong Hình 3 đã được thực hiện với Thiết bị đo một bước RT-qPCR ReadyMix™ của Thiết bị thăm dò một bước KiCqStart® (Mã số KCQS07) sử dụng RNA SARS-CoV-2 tổng hợp làm khuôn mẫu. Cả hai xét nghiệm đều cho thấy sự nhạy cảm để phát hiện thấp tới 10 bản sao của mẫu. Không quan sát thấy khuếch đại với các mẫu NTC.
A: N1 Assay
B: N2 Assay
Hình 4.Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 sử dụng Bộ tổng hợp đa năng qRT-PCR một bước ĐẦU DÒ KAPA (2x) Bộ dụng cụ đa năng (Cat. No. KK4752) cho mục tiêu mồi N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B).
Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B) trong Hình 4 đã được thực hiện với Bộ phổ biến hỗn hợp qRT-PCR một bước NHANH ĐẦU DÒ KAPA (2x) (Cat. KK4752) sử dụng RNA SARS-CoV-2 tổng hợp làm khuôn mẫu. Cả hai xét nghiệm đều cho thấy độ nhạy cảm để phát hiện ra mức thấp nhất là 10 2copies mẫu. Không quan sát thấy khuếch đại với các mẫu NTC.
A: N1 Assay
B: N2 Assay
Hình 5.Các xét nghiệm phát hiện SARS-CoV-2 sử dụng Bộ Probe ABScript II One Step RT-qPCR (Cat. No. RK20407) cho mục tiêu mồi N1 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B).
Các N1 xét nghiệm SARS-CoV-2 (đồ thị A) và N2 (đồ thị B) trong Hình 5 đã được thực hiện với Bộ dụng cụ thăm dò ABScript II One Step RT-qPCR (Cat. No. RK20407) sử dụng RNA SARS-CoV-2 tổng hợp làm khuôn mẫu. Cả hai xét nghiệm đều cho thấy sự nhạy cảm để phát hiện thấp tới 10 bản sao của mẫu. Không quan sát thấy khuếch đại với các mẫu NTC.
Kết luận
Các kết quả trên chỉ ra rằng thuốc thử RT-qPCR một bước và bộ dụng cụ lý tưởng cho việc phát hiện mục tiêu SARS-CoV-2 trong nghiên cứu SARS-CoV-2. Dựa trên thông tin này, các xét nghiệm sử dụng thuốc thử RT-qPCR một bước có thể phát hiện ít nhất 100 bản sao, hoặc trong một số trường hợp, thấp tới 10 bản sao của mẫu RNA.
For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.
Dữ liệu chưa được công bố trình bày trong bài báo kỹ thuật này là từ nghiên cứu nội bộ.
Để biết thêm thông tin về các sản phẩm RT-qPCR dành cho Phát hiện SARS-CoV-2, hãy truy cập Sigma-Aldrich.com/covid19
TRI thuốc thử® để cách ly hoàn toàn RNA
TRI reagent® lý tưởng để phân lập nhanh chóng, tiết kiệm và hiệu quả tổng RNA hoặc cách ly đồng thời RNA, DNA và protein từ các mẫu của con người, động vật, thực vật, nấm men, vi khuẩn, và nguồn gốc virus.
Sản phẩm này, một hỗn hợp của guanidine thiocyanate và phenol trong dung dịch monophase, hòa tan hiệu quả DNA, RNA và protein khi đồng nhất hóa hoặc ly giải mẫu mô. Sau khi thêm chloroform hoặc 1-bromo-3-chloropropane và ly tâm, hỗn hợp tách thành 3 pha: Một pha nước chứa RNA, pha trung gian chứa DNA và pha hữu cơ chứa protein. Sau đó, mỗi thành phần có thể được cách ly sau khi tách các pha. Một ml thuốc thử TRI® đủ để cô lập RNA, DNA và protein từ 50-100 mg mô, 5-10 tế bào cam 106 hoặc bề mặt món nuôi cấy 10 cm 2of cho các tế bào được trồng đơn lớp.
Đây là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để cô lập tổng RNA và có thể được hoàn thành chỉ trong 1 giờ bắt đầu với mô hoặc tế bào tươi. Thủ tục này rất hiệu quả để cô lập các phân tử RNA của tất cả các loại từ 0.1-15 kb về chiều dài. RNA kết quả còn nguyên vẹn với ít hoặc không có DNA và protein bị nhiễm bẩn. Nó có thể được sử dụng cho các vết mực phương Bắc, cách ly mRNA, dịch mã in vitr, xét nghiệm bảo vệ RNase, nhân bản, và PCR.
TRI reagent® đã được sử dụng rộng rãi trong việc bất hoạt vi-rút và chiết xuất RNA của virus để phát hiện SARS-CoV-2 bằng các xét nghiệm RT-qPCR trong một số nghiên cứu.1, 2, 3 Nó đã được chứng minh là lý tưởng cho sự cô lập và lưu trữ của Mi-RNA ở -800C trong thời gian dài.4 Nó đã được sử dụng trong việc chiết xuất RNA coronavirus ở mèo và chó được sử dụng thêm trong xét nghiệm RT-PCR.5, 6 Nó cũng đã được sử dụng để phân lập RNA tế bào chất từ các tế bào Vero bị nhiễm SARS-CoV. 7
For Research Use Only. Not For Use In Diagnostic Procedures.
Vật liệu
Tài liệu tham khảo
*Bài viết này là một bản in trước và chưa được đánh giá ngang hàng. Nó báo cáo nghiên cứu y tế mới chưa được đánh giá và do đó không nên được sử dụng để hướng dẫn thực hành lâm sàng.