Mistura-mestre de PCR
Tubo de reação de PCR
- O que é uma mistura-mestre de PCR ou RT-PCR?
- Aplicações de mistura-mestre
- Componentes da mistura-mestre
- Tipos de misturas-mestre
- Receita de mistura-mestre de PCR comum
- Misturas-mestre de PCR padrão
- Misturas-mestre de PCR de alta fidelidade
- Misturas-mestre de RT-PCR
- Misturas-mestre para qPCR
- Produtos recomendados para a mistura-mestre de PCR
O que é uma mistura-mestre de PCR ou RT-PCR?
Uma mistura-mestre de PCR, às vezes conhecida como super mix ou ready mix, é uma mistura em lote de reagentes de PCR em concentrações ideais que pode ser preparada e dividida entre vários tubos de PCR ou placas para PCR de 96 poços. A mistura-mestre geralmente inclui DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampão. O uso de uma mistura-mestre reduz a pipetagem e o risco de contaminação, é conveniente, economiza tempo e evita possíveis erros na mistura, tornando-a ideal para aplicações de alto rendimento.
A mistura-mestre permite que os pesquisadores estabeleçam controles e testem diferentes concentrações de seus moldes de DNA ou RNA alvo sem precisar adicionar individualmente quantidades precisas de enzimas, tampões, cofator (geralmente MgCl2), água e dNTP a cada tubo de reação ou poço de placa. Em vez disso, uma grande mistura-mestre contendo todos ou a maioria dos reagentes de PCR é preparada uma vez. A quantidade adequada de mistura-mestre pode ser pipetada em tubos ou poços de placas e combinada com quaisquer componentes que variem entre as reações, como moldes ou primers de DNA ou RNA.
As reações de PCR em larga escala podem conter 2.000 ou mais reações individuais de 25 μl a 50 μl. Mesmo para um lote de 20 reações, os pesquisadores podem economizar tempo, reduzir erros de pipetagem e melhorar a consistência com uma mistura-mestre. Essas misturas evitam que os reagentes sejam totalmente deixados de fora de uma reação, resultando em falsos negativos.
Nossa calculadora de mistura-mestre de PCR pode ajudá-lo a planejar uma receita de mistura-mestre para um lote personalizado de reações de PCR.
Aplicações de mistura-mestre para PCR
As misturas-mestre de PCR são comumente usadas nas seguintes aplicações:
- PCR de alto rendimento
- PCR de rotina
As misturas-mestre com DNA polimerase hot start são ideais para as seguintes aplicações:
- PCR multiplex
- Redução de dímeros de primers
- Configuração conveniente em temperatura ambiente compatível com automação
Os laboratórios em fases preliminares de investigação podem variar os moldes de DNA ou RNA enquanto contam com a conveniência de outros componentes pré-misturados.
Componentes da mistura-mestre para PCR
- Enzima
- Tampões
- Cofator - O cloreto de magnésio (MgCl2) é o mais comum. Às vezes, o MgSO4 é usado com enzimas específicas.
- dNTP
- Primers
- Molde de DNA (se todas as amostras forem uniformes)
- Água livre de nuclease ou de grau PCR
Tipos de misturas-mestre
Muitas misturas-mestres de PCR pré-fabricadas estão disponíveis para ajudar a economizar tempo e evitar erros de medição e proporção.
A maioria das misturas-mestres de PCR comerciais é designada para um tipo específico de PCR, como hot start, ou compatível apenas com determinados termocicladores. Isso é especialmente verdadeiro para a PCR em tempo real (também conhecida como PCR quantitativa ou qPCR), que depende de um termociclador que pode detectar a progressão da reação com base no desenvolvimento correspondente da fluorescência do corante incluído na mistura-mestre.
As misturas-mestres comerciais ainda precisam de alguma preparação antes do uso, mesmo que seja apenas para adicionar o molde de DNA ou RNA. Além disso, podem exigir descongelamento, resfriamento, diluição com água de grau PCR e mistura por meio de pipeta ou centrífuga. Certifique-se de selecionar a mistura-mestre correta para atender às suas necessidades experimentais e à configuração de PCR.
Oferecemos muitas misturas -mestres para PCR e PCR em tempo real que são validadas para vários instrumentos. Nosso prático Guia de Seleção de PCR pode ajudá-lo a identificar uma mistura-mestre apropriada ou os componentes para fazer sua própria mistura. Também traçamos o perfil de várias de nossas misturas-mestres de PCR mais vendidas por estilo de PCR:
Preparação de uma mistura-mestre comercial
Observe que essa receita típica varia de uma mistura para outra e entre usos específicos. Consulte a literatura do produto fornecida para obter informações sobre a mistura-mestre específica ou a preparação da mistura pronta.
Misturas-mestre de PCR padrão
Mistura de reação de PCR Taq ReadyMix™ com MgCl2
O ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix é uma solução preparada que contém tudo o que é necessário para uma reação de PCR, exceto os primers específicos e o modelo. A mistura inclui nossa Taq DNA polimerase de alta qualidade, 99% de desoxinucleotídeos puros e tampão em um concentrado de reação otimizado 2×.
O PCR Master da Roche contém todos os reagentes necessários para realizar um PCR padrão. Tudo o que deve ser adicionado é o molde de DNA, os primers e a quantidade necessária de água.
Mistura para reação de PCR REDTaq® ReadyMix™
Essa mistura combina o desempenho e os benefícios da nossa REDTaq® DNA polimerase com a conveniência de uma mistura de reação de PCR ReadyMix™. O REDTaq® ReadyMix™ é uma mistura pronta para uso de Taq DNA polimerase, desoxinucleotídeos 99% puros, tampão de reação e um corante vermelho inerte em um concentrado 2X.
Misturas-mestre de PCR de alta fidelidade
PCR Master de alta fidelidade da Roche
Escolha o conveniente High-fidelity PCR Master, uma mistura mestre pronta para uso, duplamente concentrada, que combina o sistema Expand High Fidelity PCR com dNTPs de grau PCR, MgCl2 e um tampão de reação otimizado.
Mistura mestre Millipore KOD Hot Start
Essa é uma mistura 2X pronta para uso, contendo KOD Hot Start DNA polimerase, dois anticorpos monoclonais, desoxinucleotídeos ultrapuros e tampão de reação com MgSO4. Essa mistura é otimizada para uma conveniente PCR de alta fidelidade.
Misturas-mestre de RT-PCR
O Roche Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit foi projetado para fazer a transcrição reversa do RNA com maior fidelidade em comparação com outras transcriptases reversas. O kit apresenta a Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase, uma mistura de uma transcriptase reversa recombinante e uma enzima mediadora de revisão otimizada para RT-PCR em duas etapas.
O kit SYBR® Green Quantitative RT-qPCR fornece um método altamente sensível para a análise quantitativa da expressão gênica. Nosso QRT-PCR ReadyMix™ combina as vantagens do M-MLV RT e do JumpStart Taq em uma conveniente mistura pronta.
O reagente KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ é uma mistura mestre pronta para uso e altamente sensível para PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR) de moldes de RNA usando produtos químicos de detecção de sonda de hibridização, como as sondas de hidrólise TaqMan® 5’ em sistemas de PCR em tempo real (consulte a seção de compatibilidade de instrumentos para selecionar o reagente apropriado para a sua máquina).
O MystiCq® microRNA cDNA Synthesis Mix contém todos os componentes necessários para converter microRNAs maduros em moldes de cDNA para qPCR. Esse kit tem etapas separadas de poliadenilação e transcrição reversa, o que permite a possibilidade de otimização do protocolo, se necessário.
Misturas-mestres para qPCR em tempo real
qPCR baseado em sonda
O FastStart TaqMan® Probe Master da Roche é uma mistura-mestre concentrada 2× pronta para uso que contém todos os reagentes (exceto primers, sonda e molde) necessários para a execução de ensaios quantitativos de detecção de DNA em tempo real, incluindo qPCR e qRT-PCR de duas etapas, no formato de detecção de sonda de hidrólise.
A Roche EagleTaq Universal Master Mix (ROX) é uma mistura-mestre de PCR concentrada 2× pronta para uso que contém todos os reagentes (exceto primers, sondas e molde) necessários para a realização de reações de sonda de hidrólise de PCR quantitativas e em tempo real. Ele contém um corante de referência ROX especial que o torna adequado para todos os instrumentos em tempo real nos quais é necessário um corante de referência ROX para análise quantitativa.
SYBR® Green PCR
As misturas-mestres SYBR® Green são adequadas para PCR em tempo real. Eles utilizam um corante de cianina assimétrico. Nossa mistura SYBR® Green mais popular é a FastStart SYBR® Green da Roche. O FastStart SYBR® Green Master é uma mistura de reagentes pronta para uso que simplifica a preparação de reações para qPCR e qRT-PCR de duas etapas usando o corante intercalante SYBR® Green I para detecção e análise de DNA.
Reagentes KiCqStart® qPCR ReadyMix™
As misturas-mestres KiCqStart® qPCR ReadyMix™ são fornecidas prontas para uso em um formato concentrado. Eles incluem tampão, estabilizadores e Taq hot-start. Use-os em protocolos de ciclo rápido ou convencional em qualquer termociclador. Escolha entre as misturas SYBR® Green ou baseadas em sonda.
A mistura- mestre KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ é compatível com os sistemas Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Illumina, Corbett e Roche. Os componentes incluem um tampão de reação 2× que contém concentrações otimizadas de MgCl2, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), KiCqStart® Taq DNA polimerase, corante SYBR® Green e estabilizadores.
O Low ROX™ funciona com o Low ROX™ para instrumentos ABI e Stratagene.
Reagentes LuminoCt™ qPCR
Com base em uma química ReadyMix™ altamente otimizada, os reagentes LuminoCt™ qPCR oferecem velocidades de ensaio insuperáveis sem abrir mão da exatidão, precisão ou sensibilidade. E o melhor de tudo é que os reagentes LuminoCt™ trabalham de forma integrada com a maioria dos instrumentos de qPCR, então a otimização de condições de reação é absolutamente mínima. Muitas vezes, os usuários podem simplesmente escolher seu kit, preparar o ensaio e começar. Gerar os melhores dados de qPCR possíveis nunca foi tão rápido e fácil.
O reagente LuminoCt™ SYBR® Green qPCR ReadyMix™ foi projetado para fornecer velocidades de ensaio insuperáveis sem sacrificar a exatidão, a precisão ou a sensibilidade. O design e a validação extensivos da química do ReadyMix™ praticamente eliminaram a necessidade de otimização quando o reagente LuminoCt™ é usado com primers adequadamente projetados. A inclusão do anticorpo JumpStart™ Taq no reagente ReadyMix™ elimina a atividade da polimerase em temperaturas ambientes, sem causar os problemas de desempenho associados à Taq quimicamente modificada para hot-start.
O kit LuminoCt™ qPCR ReadyMix™ foi concebido para a realização de ensaios de qPCR à base de sondas em plataformas de instrumentos em tempo real comumente disponíveis. O reagente ReadyMix™ requer a adição de corante de referência (fornecido no kit) ao ser usado em instrumentos em tempo real que exigem corante de referência passivo ROX para normalização de ensaios de qPCR.