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역상 생체 분자 HPLC

역상 HPLC(RP-HPLC)는 단백질, 단백질 절편, 펩타이드를 분리하고 분석하는 데 사용되는 민감하고 다용도의 기술입니다. RP-HPLC는 비극성 고정상과 극성 이동상을 사용합니다. 고정상에서 단백질과 펩타이드 보유는 흡착과 분할 원칙을 따릅니다. 소수성 단백질 부위는 고정상에 가역적으로 부착됩니다. 단백질은 이동상의 비극성 성질을 증가시켜 용출합니다. 분리능은 공극 크기, 입자 크기, 컬럼 길이 및 고정상에 부착된 탄화수소 사슬에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 분자를 크기(즉, 유체역학적 반경)로 구분하는 비변성 크로마토그래피 모드입니다. 이 모드는 고정상과 분석물의 상호작용에 의존하지 않고 정지상 입자를 통한 무작위 분석물 흐름에 의존합니다. 고분자 중량 분석은 고정상 입자 공극에서 완전히 또는 부분적으로 배제되기 때문에 더 일찍 용출되는 반면, 저분자 중량 분석은 더 많은 시간을 입자를 통해 불규칙한 경로를 탐색하는 데 소비하기 때문에 시간이 더 소요됩니다. SEC는 단일 클론 항체(mAbs) 침전과 절편의 특성, 알려지지 않은 단백질 분자량 추정, 단백질 제형 안정성 측정에 사용되었습니다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성 분석물 부분 구조와 소수성 고정상 리간드 사이의 상호작용에 따라 분석물을 분리하는 크로마토그래피 모드입니다. 분자량이 작고 접히는 성향이 낮기 때문에 HIC는 펩타이드 분리에 사용되지 않습니다. 고염농도에서 단백질 수화층은 소수성 표면 영역이 비극성 고정상과 상호작용할 수 있을 정도로 충분히 파괴될 수 있습니다. 염의 선택은 단백질 수화층(무질서)을 교란하거나 단백질 수화층 형성(안정화)을 촉진하는 능력에 의해 양이온과 음이온을 분류하는 Hofmeister 시리즈에 의해 결정됩니다. 대표적인 염류는 황산암모늄, 황산칼륨, 황산나트륨을 포함합니다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 현재 항체-약물 접합체(ADC)의 약물 대 항체 비율(DAR) 프로파일을 결정하기 위해 사용되고 있습니다.

이온 교환 크로마토그래피(IEX)

이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 분석물을 전하에 따라 분리하는 크로마토그래피 모드입니다. 단백질과 펩타이드는 산과 염기의 기능을 모두 가지는 양쪽성입니다. 산성 단백질 기능성에는 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 티로신, α-카르복실레이트 C-말단이 포함됩니다. 염기성 단백질 기능성으로는 아르기닌, 히스티딘, 리신, α-아민 N-말단이 포함됩니다. IEX를 사용하여 생체치료 전하를 띤 변종을 감지하고 분리할 수 있습니다. 전하를 띤 변종은 전령 RNA(mRNA) 전사 오류 및/또는 탈아미드화, 산화 또는 글리코실화 같은 번역 후 변형을 통해 발생할 수 있습니다.

분석물 등전점(pI)을 기준으로 IEX 컬럼을 선택해야 합니다.  이동상 pH상이 pI보다 낮으면 분석물이 양전하를 띠고 양이온 교환 컬럼에 결합합니다.  이동상 pH상이 pI보다 높으면 분석물이 음전하를 띠고 음이온 교환 컬럼에 결합합니다.

친화성 크로마토그래피

친화성 크로마토그래피는 분석물과 고정상 리간드 사이의 특정한 상호작용에 의존합니다. 이상적으로는 관심 분석물만 고정상과 상호작용하기 때문에 다른 모든 시료 성분이 컬럼을 통과할 수 있습니다. 그 다음 분석물을 용출하기 위하여 두 번째 이동상이 컬럼을 통과합니다.

단백질 A 크로마토그래피는 바이오 제약 산업에서 가장 일반적으로 사용되는 형태의 친화성 크로마토그래피입니다.  단백질 A는 S. aureus의 세포벽에서 발견되는 42kDa 표면 단백질입니다.  이 단백질은 특히 IgGs의 Fc 영역의 중쇠에 결합하는 방법으로 다른 시료 성분에서 IgG를 분리하는 이상적인 기전입니다.  대부분의 단백질 A 컬럼은 다공성 유기 입자 위에 단백질을 고정시켜 제조합니다.  그러나 단백질 A 크로마토그래피를 위한 단일화 포맷이 생산되어 효율성을 있게 다양한 유속에서 다량의 시료를 처리할 수 있습니다.

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