MISSION^® esiRNA 규격

맞춤형(custom) 및 사전설계형(predesigned) esiRNA

2020년 10월 말/11월 초부터 esiRNA, esiOPEN, esiSEC제품의 개별주문 건은 용액 상태가 아닌 동결 건조된 상태로 튜브에 담아 배송됩니다(esiLibrary와 esiFLEX제품은 지속적으로 용액 상태로 플레이트에 담아 배송됩니다) 변경되는 대부분의 esiRNA제품은 다음과 같은 이유로 튜브 용기로 변경됩니다.

1. 드라이아이스로 배송되던 기존의 제품들과는 달리 동결 건조 제품은 상온에서 배송이 가능합니다. 이로 인한 배송비용 절감은 esiRNA 제품 가격을 가능한 저렴하게 유지될 수 있도록 도움을 줍니다.
2. 배송물에서 드라이아이스를 제거하면 포장재를 덜 사용하게 되므로 환경 오염물을 최소화할 수 있습니다. 이는 친환경 방침을 고수하는 자사의 정책과 일치합니다. esiRNA는 다른 RNA제품과 마찬가지로 실온에서 최소 3주 동안 안정되게 유지됩니다. esiRNA배송이 완료되면, 사용전까지 -20 °C 냉동실에 보관하십시오. Technical Bulletin(제품 기술 회보)의 Appendix2(부록2)에 재현탁 프로토콜이 포함되어 있습니다. 전환 기간 동안, 일부 esiRNA는 여전히 용액 상태로 배송되며 일부는 건조 상태로 배송될 것입니다. 가능한 빠른 시일에 모든 유닛을 동결건조 상태로 이전하도록 하겠습니다.

esiRNA와 관련된 모든 주문 및 견적 옵션은 하기 규격표를 통해 확인할 수 있습니다

MISSION^® esiRNA는 Eupheria Biotech과 협력하여 개발되었습니다. 이는 단백질 발현 유전자와 lncRNA(long non-coding RNA)의 전사 후 침묵화를 수행하는 검증된 방법으로 간단하게 사용할 수 있으며, 저렴한 비용에 RNAi 연구자들에게 제공되고 있습니다. 생물학적으로 조제된 esiRNA는 모두 동일한 mRNA 염기서열을 표적으로 하는 siRNA(천연 RNA, 변형 없음)의 이종 풀(heterogeneous pool)로 구성됩니다. 이러한 다중 침묵 유발인자들은 화학적으로 합성된 단일 siRNA에 비해 표적 이탈 효과(off-target effect)가 낮아 탁월한 특이성을 가져 효과적으로 유전자를 녹다운시킵니다.(그림 1).

그림 1. 표적 mRNA의 녹다운 현상은 화학적으로 합성된 siRNA 또는 효소를 이용해 조제된 siRNA(esiRNA)를 통해 구현할 수 있습니다. A) 화학적으로 합성된 siRNA는 표적 mRNA에 상보적인 21 bp의 단일 침묵화 유발인자입니다. Transfection 반응에서 고농도의 siRNA를 사용하므로 비교적 높은 표적 이탈(off-target) 효과를 유발합니다. B) 반면에 esiRNA는 표적 mRNA의 300 ~ 600 bp 영역을 표적으로 하는 수백 개의 siRNA(21 bp)를 모은 하나의 풀(pool)로 구성됩니다. 개별 siRNA는 풀에서 낮은 농도로 사용이 가능하므로 표적 이탈 효과를 감소시키면서도 효율적인 녹다운 현상을 유발합니다.

제품 이점

• 보장된 유전자 침묵화 효과
• 화학적으로 합성된 단일 siRNA와 비교하여 낮은 표적 이탈 효과
• 높은 표적 적중 특이성(on-target specificity)으로 일차 스크리닝에 효과적으로 이용됨(그림 2)
• 합리적인 비용의 유전체급 RNAi 스크리닝 도구

그림 2. esiRNA로 Transfection된 HeLa 세포의 유전자 녹다운 평가분석. mRNA 및 단백질 수준에서 음성 대조군인 Renilla Luciferase와 여러 표적들에 대한 녹다운효과 비교분석. A) Transfection반응 24시간 후 녹다운효과를 검증한 qPCR 데이터. mRNA 발현양은 모든 transfection반응에서 >90% 감소함. B) Transfection반응 72시간 후 녹다운을 검증하는 정량적 웨스턴 블롯 데이터. 단백질 발현양은 45 ~ 95% 감소함.

제품 특징

다음사항들은 esiRNA 규격표에 제시된 모든 제품 옵션에 적용됩니다.

• 정제: Q-Sepharose 분리, 이소프로판올 침전, 에탄올 세척
• 염기서열 형태: 듀플렉스 길이가 평균 21 bp인 수백 개의 siRNA 풀
• 품질 관리: 두 단계로 수행됨
  o   cDNA 클론의 PCR 산물은 젤 전기영동법 및 DNA 서열분석법으로 분석됨
  o    분해 반응은 젤 전기영동법으로 분석됨
• 안정성: -20°C에 보관 시 2년간 사용 가능

아래에 '문의'로 표시된 항목에 대해 또는 제시된 다른 일반 사양과 다른 요구사항이 있는 경우 sirnarequest@milliporesigma.com으로 연락 부탁드립니다.

전체 제품 목록을 확인하고자 한신다면 사전설계형 esiRNA를 클릭해 주십시오.

*DEQOR은 esiRNA용 설계 알고리즘입니다. 자세한 설명은 Henschel A, Bucholz F & Habermann B(2004)를 참조하십시오. DEQOR: siRNA의 설계 및 품질 관리를 위한 웹 기반 도구. Nucleic Acids Res, 32, W113-120.

esiRNA 제품 옵션 및 규격
개별 esiRNA	정의: 단일 단백질 발현 유전자 및 lncRNA에 대한 사전설계형 개별 esiRNA(Accession No.로 lncRNA 검색). 모든 esiRNA는 ENSEMBL 데이터베이스의 주석을 기반으로 디자인되었습니다. 종: 인간, 마우스 수량: 20µg, 50 µg 형태: 튜브에 담긴 동결건조 형태 또는 200 ng µL-1의 농도로 TE 완충액에 담아 96-well 또는 384-well 플레이트에 제공 (플레이트는 추가 문의 필요)
esiLibrary	정의: whole genome 및 lncRNA 전사체에 대한 사전설계형 esiRNA 라이브러리. 모든 esiRNA는 ENSEMBL 데이터베이스의 주석을 기반으로 디자인됨. 종: 인간, 마우스 수량: 1µg, 2.5µg, 5 µg 형태: 50 ng µL-1의 농도로 nuclease-free TE 완충액에 담아 96-well 또는 384-well 플레이트에 제공 견적 요청
esiFLEX	정의: whole genome 및 lncRNA 전사체 제품군에서 선택한 맞춤형 배열. 모든 esiRNA는 ENSEMBL 데이터베이스의 주석을 기반으로 디자인됨. 종: 인간, 마우스 수량: 1µg, 2.5µg, 5 µg 형태: 50 ng µL-1의 농도로 nuclease-free TE 완충액에 담아 96-well 또는 384-well 플레이트에 제공 최소 배열 크기: 표적 24개 견적 요청
esiOPEN	정의: 단일 단백질 발현 유전자 및 lncRNA를 위한 맞춤형 esiRNA. 500 bp 표적 염기서열을 제공하며 DEQOR*을 이용하여 esiRNA를 설계함. 종: 일체 수량: 20µg, 50 µg 형태: 튜브에 담긴 동결건조 제품 견적 요청
esiSEC	정의: 단일 단백질 발현 유전자 및 lncRNA를 표적으로 하는 1차 esiRNA를 검증하기 위한 개별, 2차, 독립적 esiRNA. 모든 esiRNA는 ENSEMBL 데이터베이스의 주석을 기반으로 디자인됨. 종: 인간, 마우스 수량: 20µg, 50 µg 형태: 튜브에 담긴 동결건조 제품 견적 요청

esiRNA 대조군

다음과 같이 다양한 양성 및 음성 대조군을 사용할 수 있습니다(그림 3).

• 양성 대조군: Transfection효율 및 실험 방법의 최적화를 위한 인간 Eg5(KIF11) 및 마우스 Eg5(Kif11) esiRNA를 포함한 검증된 모든 esiRNA(아래의 표 참조)
• 음성 대조군: 염기서열 특이적 침묵을 비특이적 효과와 구별하기 위해 사용되는 RLUC, FLUC, EGFP(EGFP는 EGFP를 발현하는 세포에서 양성 대조물로 사용할 수 있음) esiRNA

그림 3. A) RLUC(음성 대조군) 및 B) Eg5/KIF11(양성 대조군)에 대해esiRNA로 transfection된 HeLa세포의 표현형 분석. RLUC esiRNA는 표현형 변화를 유도하지 않는 반면, Eg5/KIF11 esiRNA는 유사분열 정지를 유발하여 원형 세포로 보여짐.

검증된 esiRNA

일반적으로 사용되는 다수의 유전자표적들에 대한 ≥70%의 mRNA 녹다운 효능이 확인되었습니다(qPCR 및 웨스턴 블롯 검증 데이터). 다음 표를 이용해 주로 주문되는 esiRNA의 타겟 유전인자 기호를 확인하십시오. 검증된 esiRNA제품은 transfection 최적화 및 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다.

유전자 기호에 따른 검증된 인간 esiRNA
ANAPC1	DCTN2	PLK4
ANAPC10	CETN3	RAD21
ANAPC5	H3F3A	EDC4
AURKB	INCENP	SEC13L1
PPP2R3C	KIF11	SEH1L
CENPA	KIF23	SUV39H2
CEP192	LMNA	TACC3
CETN2	MAD2L1	TUBG1
CKAP5	NEK2	TUBGCP3
CLASP1	NUMA1	TPX2
CCP110	NUP37

lncRNA esiRNA

게놈의 최대 90%가 lncRNA를 포함하는 비암호화 RNA로 전사된다는 것은 전사체 분석을 통해 널리 알려져 있습니다. lncRNA는 염색질 변형, 전사 인자의 공동 활성화, 전사, RNA 결합 단백질과의 상호 작용, 프로모터 억제를 비롯한 다양한 기능과 연관되어 있습니다. 또한, lncRNA는 암과 같은 질병과도 관련이 있습니다. 그럼에도 lncRNA가 어떻게 작용하는지에 대한 자세한 내용은 추가 연구가 필요합니다. esiRNA는 lncRNA 기능을 연구하는 효과적인 스크리닝 도구입니다(그림 4).

그림 4. 해당 esiRNA로 tranfection반응 24시간 후 HeLa 세포에서 lncRNA 녹다운 효과를 검증하는 qPCR 데이터. 대조군인 RLUC esiRNA로 함께 transfection시키고 정규화 진행.

제품 제조과정

생물학적으로 조제된(그림 5) esiRNA는 내부 리보핵산 가수분해효소(endoribonuclease)인 E. coli RNase III을 사용해 긴 dsRNA(이중 가닥 RNA)를 분할하여 제조됩니다.

그림 5. 단일 유전자에 대한 esiRNA의 제조 과정 개요. A) DEQOR 디자인 툴을 사용하여 고효율의 siRNA를 다수 생성하고, 알려져 있는 모든 전사 변이체를 포함하며, 표적 이탈 효과를 최소화하는 mRNA 표적 영역을 선정합니다. B) 표적 영역은 cDNA 클론에서 추출되고 PCR을 통해 증폭됩니다(두 프라이머 모두 T7 프로모터를 도입합니다). C) PCR 산물은 RNA 중합효소를 사용하여 in vitro로 전사됩니다. D) 접합된 상태의 긴 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 RNase III로 분해되며 정제과정을 통해 DNA 원형과 잔류 NTP, 불완전하게 분해된 dsRNA를 제거합니다. 마지막으로 esiRNA는 평균 듀플렉스 길이가 21 bp인 수백 개의 siRNA를 모은 풀로 준비됩니다.

esiRNA 보증절차

MISSION^® esiRNA는 ≥30 nM의 농도에서 transfection되는 경우, 배양 세포에서 포적 mRNA 수준을 70%이상 감소시킵니다. esiRNA가 표적 유전자를 70%까지 녹다운하지 않는 경우, 자사는 해당 유전자에 대한 추가 esiRNA를 무료로 제공합니다. 해당 유전자에 대한 esiRNA가 더 이상 없으면 자사는 구매 가격을 환불해 드립니다.

추가 제품이나 환불을 받기 위해서는 transfection 효율에 대한 적절한 데이터를 제출해야 합니다. Transfection 효율에 대한 적절한 데이터에는 ≥30 nM에서 transfection된 MISSION^® esiRNA의 표적 mRNA 발현정도를 적절한 음성 대조군(예: RLUC, FLUC, eGFP esiRNA로 transfection)과 비교한 결과가 70%미만의 표적mRNA 녹다운 효과가 나왔다는 것을 검증하는 qPCR 데이터입니다.

항체 및 단백질 반감기의 가변성으로 인해, 자사는 단백질 기반 검출 방법의 데이터를 수용할 수 없습니다.

자주 묻는 질문

esiRNA에 대해 자세히 알아보려면, 자사의 자주 묻는 질문 섹션을 방문하십시오.

동영상 강의

esiRNA를 사용한 포유류 세포의 스크리닝에 대해 알아보십시오.

추가적인 도움이 필요한 경우 당사의 기술 서비스 부서에 문의하십시오(이메일: sirnarequest@sial.com).

RNA 간섭에 대해 자세히 알아보기: 단일 유전자 연구부터 전유전체 스크리닝까지 - 율리아 크뤼거(Julia Krüger) 박사(Eupheria Biotech GmbH 선임 과학자)

문헌 인용

단일 유전자 esiRNA

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lncRNA esiRNA

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