การวิเคราะห์เมลามีนในนม

Olga Shimelis, Carmen T. Santasania

AnalytiX Volume 9 Article 1

Section Overview

• บทนำ
• การอภิปราย
• สรุป
• ข้อมูลอ้างอิง

บทนำ

ข่าวล่าสุดจากจีน 1 ได้รายงานเหตุการณ์เกี่ยวกับนมผลิตภัณฑ์นมและสูตรสำหรับทารกที่ปนเปื้อนด้วยเมลามีนซึ่งเป็นสารที่ใช้ในการผลิตพลาสติกและปุ๋ย ไม่ได้รับการอนุมัติให้ใช้ในอาหารแต่เจ้าหน้าที่สาธารณสุขรายงานว่าเมลามีนถูกเพิ่มลงในผลิตภัณฑ์นมเหล่านี้เพื่อขยายปริมาณโปรตีนที่ปรากฏ ทารกหลายคนเสียชีวิตและเด็กหลายพันคนเข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลหลังจากที่ไตวายจากการกินนมเมลามีนปลอมปน ห้องปฏิบัติการทั่วโลกกำลังพัฒนาวิธีการทดสอบผลิตภัณฑ์สำหรับเมลามีน

MILK เป็นเมทริกซ์ตัวอย่างที่ซับซ้อนและต้องการการเตรียมตัวอย่างอย่างระมัดระวังเพื่อให้ได้ผลลัพธ์เมลามีนที่ถูกต้อง เรานำเสนอสารเคมีเมลามีนและกรดไซยาไนด์ที่มีความบริสุทธิ์สูงซึ่งช่วยให้ลูกค้าสามารถเตรียมมาตรฐานของตนเองเพื่อตอบสนองความต้องการในการใช้งานเฉพาะ ของพวกเขารวมถึงผลิตภัณฑ์สกัดแบบโซลิดเฟส Discovery ® เพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างที่สะอาดและ คอลัมน์ Ascentis ® HILIC เพื่อให้ได้ผลลัพธ์โครมาโตกราฟฟิกที่เหนือกว่า

การอภิปราย

Sample extraction

ตัวอย่างนม 5 มล. ถูกเติมด้วยเมลามีนมาตรฐาน (52549) จากนั้นใส่บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 5 มล. (ขนาด 100 มม., pH 2.5 และ acetonitrile ขนาด 1 มล. ลงในตัวอย่างและตั้งค่าในอ่างอัลตราโซนิคเป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 3500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและส่วนกลางที่ลอยอยู่แยกจากชั้นบนและชั้นล่าง

Sample SPE preparation

 ใช้หลอด SPE ขนาด 500 มก./ 6 มล. ของ Supelco ® Discovery DSC-SCX (52688 U) สำหรับการทำความสะอาดตัวอย่างเพิ่มเติม หลอด SPE ถูกปรับสภาพด้วยเมทานอล 3 มล. และบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 100 มม. 3 มล. (pH 2.5 จากนั้น 2.2 มล. ของสารลอยตัวที่เกิดขึ้นถูกบรรจุลงในหลอด SPE และล้างด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 3 มล. (100 มม., pH 3 และเมทานอล 3 มล. เมลามีนถูกเจือจางด้วยแอมโมเนีย 4 มล. 5% ในเมทานอล ตัวทำละลายเจือจางถูกระเหยเป็นความแห้งที่ 50°C ในอ่างน้ำภายใต้การไหลของไนโตรเจนที่ 5 psi ตัวอย่างถูกสร้างขึ้นใหม่เป็น 1 มล. ของ LC MOBILE PHASE A (ดูเงื่อนไขด้านล่าง)

LC-MS-MS method

เมลามีน (รูปที่ 1 2) เป็นโมเลกุลเชิงขั้วที่มี pKa เท่ากับ 5.6 และค่า Log P เท่ากับ 1.37 ทำให้เป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับโครมาโตกราฟีเฟสปกติ (ANP) ใน ANP พาร์ติชันการวิเคราะห์เชิงขั้วน้ำระหว่างเฟสที่ค่อนข้างขั้วและเฟสมือถือที่ไม่มีขั้ว ANP มักเรียกว่า HILIC แต่คำว่า HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) หมายถึงกลไกที่เป็นหนึ่งในหลายๆอย่างที่อาจใช้งานได้ภายใต้เงื่อนไข ANP การกำหนดปริมาณเมลามีนโดยใช้โหมด HILIC ทำงานบนคอลัมน์ HILIC ของ Supelco (53939 U) ช่วยให้การเก็บรักษาโมเลกุลขั้วดีกว่าโครมาโตกราฟีแบบย้อนกลับแบบเดิม

รูปที่ 1 โครงสร้างของเมลามีน

กลไก HILIC นี้อธิบายถึงกระบวนการของการละลายพิเศษของเฟสขั้วอยู่กับที่กับส่วนประกอบน้ำของเฟสมือถือและการสูญเสียที่ตามมาของเฟสมือถือของน้ำ ซึ่งเป็นการตั้งค่าระบบ Biphasic ที่มีชั้นน้ำกึ่งตรึงอยู่ใกล้กับพื้นผิวและชั้นเฟสมือถือที่อุดมไปด้วยสารอินทรีย์ สารประกอบเชิงขั้วอาจแยกออกจากระยะเคลื่อนที่ที่อุดมด้วยสารอินทรีย์ที่เคลื่อนที่เข้าสู่ตัวทำละลายน้ำที่หยุดนิ่งใกล้กับพื้นผิว จากนั้นน้ำจะกลายเป็นตัวทำละลาย“แข็งแรง”และ analytes โดยทั่วไป elute (สมมติว่า HILIC เป็นกลไกที่โดดเด่น) ตามลำดับของการ“ลดลง” hydrophobicity (บันทึกต่ำกว่า P แสดงให้เห็นถึงโมเลกุลขั้วมากขึ้นและการเก็บรักษามากขึ้น)

การตรวจจับเมลามีนทำได้โดยใช้ ABI/MDS Sciex ® 3200 QTRAP^{® MS/MS} ที่มีพารามิเตอร์ด้านล่าง มีการตรวจสอบทรานซิชันการตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรูปแบบ (MRM) สองทรานซิชัน ; 127/85 MRM ถูกใช้สำหรับการวัดปริมาณ

พารามิเตอร์เครื่องมืออื่นๆมีดังนี้:
ม่านแก๊ส: 20
แรงดันไอออนสเปรย์: 5000
แก๊ส 1
350°C
แก๊ส 2 40

การวัดค่า
เส้นโค้งการปรับเทียบภายนอกถูกใช้สำหรับเมลามีน มาตรฐานการสอบเทียบภายนอกได้รับการจัดเตรียมไว้ในเฟสเคลื่อนที่ ไม่มีการใช้มาตรฐานที่ตรงกับเมทริกซ์

เนื่องจากเมลามีนมักจะมีอยู่ร่วมกับกรดไซยาไนด์และทั้งสองรูปแบบที่ซับซ้อนมีเสถียรภาพมากเรายังทดสอบเมลามีนจากนมในที่ที่มีกรดไซยาไนด์ ทั้งเมลามีนและกรดไซยาไนด์ผสมกันที่ 1000 นาโนกรัม/มล. ในน้ำและเก็บตัวอย่างไว้เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นนมจะถูกเติมที่ 100 นาโนกรัม/มล. ของส่วนผสมและการวิเคราะห์ที่ตามมาจะให้อัตราการฟื้นตัวของเมลามีนร้อยละ 94

นอกจากนี้เรายังได้ตรวจสอบผลกระทบของไอออไนเซชันของตัวอย่างที่ทำความสะอาดโดยการเติมเมลามีนลงในตัวอย่างนมเปล่าที่ทำความสะอาดแล้วตามด้วยการวิเคราะห์ด้วย LC-MS-MS การทดสอบนี้สามารถเป็นตัวบ่งชี้ประสิทธิภาพของการทำความสะอาดตัวอย่างตัวอย่างที่ทำความสะอาดแล้วไม่ควรมีผลต่อการทำให้เป็นไอออนของการวิเคราะห์ที่สนใจ ความเข้มข้นที่เติมลงไปคือ 100 นาโนกรัม/มล. และความเข้มข้นที่พบคือ 105 นาโนกรัม/มล. ซึ่งแสดงว่าไม่มีผลต่อไอออไนเซชันจากตัวอย่างที่ทำความสะอาดแล้ว

รูปที่ 2 LC-MS-MS การวิเคราะห์เมลามีนที่สกัดจากนมที่มีฟองนม 100 นาโนกรัม/มล

สรุป

การใช้ตลับหมึก Supelco Discovery DSC-SCX SPE เป็นการพัฒนาวิธีการเตรียมตัวอย่างสำหรับการสกัดเมลามีนจากนม พบการฟื้นตัวที่ดีสำหรับเมลามีนที่ความเข้มข้นระหว่าง 10 นาโนกรัม/มล. และ 500 นาโนกรัม/มล. มาตรฐานที่พัฒนาขึ้นด้วยเมลามีนที่มีความบริสุทธิ์สูงและสารเคมีกรดไซยาไนด์ของเราช่วยให้มั่นใจได้ถึงผลลัพธ์ที่ถูกต้อง สุดท้าย HILIC กับคอลัมน์ Ascentis Express HILIC HPLC ให้การเก็บรักษาที่ดีของ analyte ข้อดีเพิ่มเติมของโหมด HILIC คือการตอบสนอง MS ที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากความเข้มข้นสูงของสารอินทรีย์ในเฟสมือถือ

ข้อมูลอ้างอิง

1. Spears L, Lawrence 1. 2008. China Milk Scandal Widens as Melamine Found in Yogurt. [Internet]. Bloomberg.[updated 15 Sep 2008; cited 06 Nov 2008]. Available from: http://www.bloomberg.com/apps/news?pid=20601087&sid=aPYE0JvTLHQA&refer=home

2. ACD/ LogP DB, version 11.01. 2007. Advanced Chemistry Development. [Internet]. Toronto ON, Canada: Available from: www.acdlabs.com.

• QTRAP เป็นเครื่องหมายการค้าจดทะเบียนของ AB Sciex Pte. Ltd. Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies ซึ่งเป็นบริษัทร่วมทุนระหว่าง Applied Biosystems และ MDS Inc.
  
• MDS and SCIEX are registered trademarks of MDS Inc.