มาตรฐาน PCR Protocol

วิธีการทำ PCR

การตั้งค่าปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสมาตรฐาน (PCR) ประกอบด้วย ขั้นตอนต่างๆดังนี้:

1. เพิ่มต้องใช้ น้ำยา มาสเตอร์มิกซ์ของ dreagent sor และเทมเพลตลงในหลอด PCR
2. ผสมและปั่นเหวี่ยง
   * เพิ่มน้ำมันแร่เพื่อป้องกันการระเหยในไซเลอร์ความร้อนโดยไม่ต้องมีฝาอุ่น
3. ขยายต่อเทอร์โมไซเซอร์และพารามิเตอร์ไพรเมอร์
4. ประเมินดีเอ็นเอขยายโดย agarose เจล electrophoresis ตามด้วย ethidium bromide staining

ขั้นตอนเหล่านี้จะแสดงอยู่ด้านล่างโดยละเอียดพร้อมกับวัสดุและเคล็ดลับการเลือกน้ำยา นี่คือโปรโตคอล PCR พื้นฐานที่ใช้โพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq

ขั้นตอน PCR และองค์ประกอบ PCR ที่จำเป็น

การแก้ไขปัญหาปฏิกิริยา PCR มีหลายปัจจัย ดูภาพเคลื่อนไหวนี้เพื่อเรียนรู้ว่าการเลือกองค์ประกอบที่เหมาะสมและสภาพการขี่จักรยานที่เหมาะกับความต้องการของคุณจะช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดได้อย่างไร

ค้นหาโพลิเมอร์หรือเทคนิค PCR ขั้นสูงอื่นๆเพิ่มเติมได้ใน ส่วนโปรโตคอลในคู่มือ PCR Technologies ของเรา

เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ PCR มาตรฐานรวมถึงสิ่งที่อยู่ใน หน้าข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับ PCR ของเรา

น้ำยา: PCR จำเป็นต้องใช้อะไรบ้าง

  

Taq DNA Polymerase เป็นเอนไซม์ที่มีความร้อนได้มาจากแบคทีเรีย Thermophilic Thermamus aquaticus  ฉัน มักใช้ในการขยายส่วนดีเอ็นเอใน PCR เอนไซม์อยู่ในรูปแบบ recombinant แสดงใน E. coli สามารถทนต่อความร้อนซ้ำได้ถึง 95°C (ตามที่ต้องการโดยเทคนิค PCR) โดยไม่สูญเสียกิจกรรมอย่างมีนัยสำคัญ เอนไซม์มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 94 KDA โดย SDS-page โดยไม่มีกิจกรรม endonuclease หรือ exonuclease ที่ตรวจพบได้ มันมีกิจกรรม DNA polymerase 5→3 ' และ กิจกรรม exonuclease 5→3 ' แต่ละล็อตของ Taq DNA Polymerase ได้รับการทดสอบสำหรับการขยาย PCR และการจัดลำดับสองชั้น เอนไซม์นี้มีให้ที่  5 หน่วย/µL และมาพร้อมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 10 เท่าที่ดีที่สุด

มาตรฐาน Taq DNA Polymerase

ใช้ตารางด้านล่างเพื่อเลือกส่วนผสมที่เหมาะสมของ  พอลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq สำหรับสภาวะการตอบสนองของคุณ เลือกจากสูตรย้อมสีใสหรือสีแดงที่มีและไม่มีแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl₂) หรือ readymix ที่เตรียมไว้ล่วงหน้าหรือผสมหลักกับบัฟเฟอร์และ dNTPs

Unit Definition: หนึ่งหน่วยประกอบด้วยไตรฟอสเฟต deoxyribonucleoside รวม 10 นาโนโมลเป็นดีเอ็นเอที่ตกตะกอนของกรดใน 30 นาทีที่ 74°C

ขั้นตอน: ขั้นตอนของ PCR

สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับความเข้มข้นของ  พอลิเมอเรสดีเอ็นเอของ Taq, ดีเอ็นเอเทมเพลต, ไพรเมอร์และ MgCl₂ จะขึ้นอยู่กับระบบที่ใช้ อาจจำเป็นต้องกำหนดสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับแต่ละองค์ประกอบ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ  โพลิเมอร์ดีเอ็นเอของ Taq พารามิเตอร์การขี่จักรยานและ ความเข้มข้นของ MgCl 2 ขอแนะนำให้ใช้เอนไซม์และ MgCl₂ เพื่อกำหนดประสิทธิภาพที่ดีที่สุด

1. เติมน้ำยาลงในหลอดที่มีขนาดเหมาะสม ตามลำดับที่ระบุไว้ในตาราง (เลือกตารางที่เหมาะสมสำหรับการตั้งค่าปฏิกิริยา: น้ำยามาตรฐานหรือน้ำยาผสมใหม่) สำหรับปฏิกิริยาจำนวนมาก  ควรตั้งค่า mastermix ที่ไม่มีเทมเพลตและแบ่งเป็นหลอดปฏิกิริยา ในตอนท้ายควรเพิ่มเทมเพลตลงในหลอดที่เหมาะสม
   

ปฏิกิริยา PCR มาตรฐาน

* ซื้อบัฟเฟอร์และ Ta qpolymerase ด้วยกัน: D1806, D430 9 หรือ D4545

ปฏิกิริยา PCR ของ Readymix

2. ผสมเบาๆด้วยน้ำวนและปั่นเหวี่ยง เป็นเวลาสั้นๆเพื่อเก็บส่วนประกอบทั้งหมดไว้ที่ด้านล่างของหลอด

หมายเหตุ: เติมน้ำมันแร่ 50 มล. ที่ด้านบนของท่อแต่ละหลอดเพื่อป้องกันการระเหยหากใช้ไซโคลนร้อนที่ไม่มีฝาปิด µL ความร้อน

3. ขยายเสียง พารามิเตอร์การขยายจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับไพรเมอร์และวงจรระบายความร้อนที่ใช้ อาจจำเป็นต้องปรับระบบให้เหมาะสมสำหรับไพรเมอร์เทมเพลตและวงจรระบายความร้อนแต่ละตัว

พารามิเตอร์การขี่จักรยานทั่วไป

แนะนำให้ใช้การขยายสัญญาณ 25-30 รอบ

4. ดีเอ็นเอที่ขยายสามารถประเมินได้โดย agarose เจล electrophoresis และการย้อมสี ethidium bromide ตามมา

    การซ้อนทับของน้ำมันแร่อาจถูกลบออกโดยการสกัดคลอโรฟอร์มเดี่ยว (เวลา 1 น 1.) ซึ่งเป็นการกู้คืนเฟสน้ำ

ตัวทำปฏิกิริยาสำหรับอิเล็กโทรโฟเรซิสของกรดนิวคลีอิก

• Agarose (เจลสำเร็จรูป, ผงฯลฯ)
• บัฟเฟอร์ เช่น MOPS-EDTA โซเดียมอะซิเตต, ทริส - อะซิเตต - EDTA (TAE) หรือทริส - โบราต - EDTA (TBE)
• โซลูชันการโหลดเจลและบัฟเฟอร์การโหลดตัวอย่างสำหรับ RNA
• รอยเปื้อนอิเล็กโทรโฟเรซิสหรือดีมาก เป็น ethidium bromide

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

ใบแจ้งยอดใบอนุญาตฉลาก

ประกาศสำหรับผู้ซื้อ: DISCLAIMER OF LICENSE

ไม่มีใบอนุญาตใดๆที่ได้รับการถ่ายทอดด้วยการซื้อผลิตภัณฑ์นี้ภายใต้สิทธิบัตรของสหรัฐอเมริกาหมายเลข 5,804,375 5,538,848 6,171,785 6,214,979 5,994,056 5,723,591 5,876,930 6,030,787 และ 6,258,569 และสิทธิบัตรที่เกี่ยวข้องนอกสหรัฐอเมริกาหรือสิทธิบัตรหรือการใช้สิทธิบัตรอื่นๆที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการย้อมสี Nuclease และ dsDNA ผูกพัน 5 สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมโปรดติดต่อผู้อำนวยการฝ่ายลิขสิทธิ์, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404 ประเทศสหรัฐอเมริกา