โปรโตคอล Annealing Oligos

Section Overview

• What is Annealing?
• การอบอ่อน oligonucleotides พิธีสาร
• อุปกรณ์และอุปกรณ์การอบแห้ง DNA/RNA
• DNA/RNA Annealing Method
• สูตรบัฟเฟอร์สำหรับการอบแห้งดีเอ็นเอและคำอธิบายของส่วนประกอบ

What is Annealing?

การหลอม oligos เป็นขั้นตอนสำคัญในชีววิทยาโมเลกุลเพราะมันอำนวยความสะดวกในการก่อตัวของดีเอ็นเอสองควั่นจากการเสริม oligonucleotides เดี่ยวควั่น กระบวนการนี้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการใช้งานปลายน้ำที่ถูกต้องเช่น PCR, การโคลนยีนและการจัดลำดับซึ่งจำเป็นต้องมีการจับคู่ฐานที่ถูกต้องของเส้นดีเอ็นเอ หากไม่มีการหลอมที่เหมาะสมอาจเกิดการจับคู่ที่ไม่ถูกต้องหรือการผสมข้ามที่ไม่สมบูรณ์ซึ่งนำไปสู่ประสิทธิภาพที่ลดลงข้อผิดพลาดในการขยายหรือการสังเคราะห์ยีนที่ไม่ถูกต้อง นอกจากนี้การหลอม oligo ช่วยให้มั่นใจได้ว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีความเสถียรและพร้อมสำหรับปฏิกิริยาเอนไซม์เช่น ligation หรือ replication ทำให้เป็นเทคนิคพื้นฐานในการวิจัยทางพันธุกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพ

การอบอ่อน oligonucleotides พิธีสาร

โปรโตคอลนี้ใช้สำหรับการหลอม oligonucleotides เดี่ยวสองตัวที่มีลำดับเสริม (รูปที่ 1) เครื่องทำความร้อนตามด้วยการระบายความร้อนช่วยให้สามารถผสมข้ามได้

รูปที่ 1 ตัวอย่างของปฏิกิริยาการหลอม ความร้อน ' แบ่ง ' พันธะไฮโดรเจนทั้งหมดจึงรบกวนโครงสร้างรองใดๆภายในแต่ละ oligonucleotide การระบายความร้อนแบบช้าจะช่วยให้เกิดการผสมข้ามพันธุ์เป็นพันธะไฮโดรเจนรูปแบบใหม่ระหว่างลำดับเสริม

คำจำกัดความ/อักษรย่อ

• EDTA: กรด Ethylenediaminetraacetic
•  
•  ฐาน Trizma ®: ชื่อแบรนด์สำหรับ Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane]
• oligo: ย่อมาจาก oligonucleotide หรือ oligomer Oligonucleotides เป็นโมเลกุล DNA หรืออาร์เอ็นเอที่มีความสั้นและมีความเป็นเกลียวเดี่ยวซึ่งต้องได้รับการอบ (ร้อนหรือละลาย) เพื่อให้สามารถยึดเกาะและสร้างเกลียวคู่ที่มีดีเอ็นเอเสริมหรืออาร์เอ็นเอที่เหมาะสม
• การหลอม DNA: หน้านี้อธิบายถึงกระบวนการหลอมสำหรับ oligonucleotides ทั้งหมด บางครั้งการหลอมจะเรียกว่าการหลอมดีเอ็นเอแม้ว่ากระบวนการจะใช้สำหรับอาร์เอ็นเอเช่นกัน การอบอ่อนเป็นกระบวนการของความร้อนและความเย็นสอง oligonucleotides เดี่ยวที่ควั่นกับลำดับเสริม ความร้อนทำลายพันธะไฮโดรเจนทั้งหมดและการระบายความร้อนช่วยให้พันธะใหม่เกิดขึ้นระหว่างลำดับ

อุปกรณ์และอุปกรณ์การอบแห้ง DNA/RNA

• บล็อกความร้อนหรือเทอร์โมไซเซอร์
• หลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 2 มล
• Pipette tips
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA (หมายเลขผลิตภัณฑ์ E9884)
• NaCl (หมายเลขผลิตภัณฑ์ S3014)
•  ฐาน Trizma ® (หมายเลขผลิตภัณฑ์ 93362)
• สอง oligonucleotides เดี่ยว ที่มีลำดับเสริม

DNA/RNA Annealing Method

กระบวนการหลอมแบ่งออกเป็นสองขั้นตอนหลัก: 1) การละลายและ 2) การอบอ่อนทั้งโดยบล็อกความร้อนหรือเทอร์โมไซเซอร์

Oligo Dissolution

แม้ว่า oligonucleotide แต่ละตัวจะมีปริมาณที่วัดได้เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดให้ตรวจสอบด้วยสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เพื่อให้แน่ใจว่ามีการเติม oligonucleotide แต่ละตัวในปริมาณที่เท่ากันลงในปฏิกิริยา

• ละลาย oligonucleotide แต่ละตัวในปริมาณของ Annealing Buffer (ดูสูตรบัฟเฟอร์ด้านล่าง) เพื่อให้แต่ละคนมีความเข้มข้นเท่ากัน
• ความเข้มข้นของแต่ละ oligonucleotide จะต้องเป็น 2 เท่าของความเข้มข้นที่ต้องการของ oligonucleotide ดูเพล็กซ์

ตัวอย่าง

ความเข้มข้นที่ต้องการของ oligonucleotide µM ดูเพล็กซ์คือ 50 μ m

1. Oligonucleotide 1 49.9 ส่งมอบ 10.55 OD (1 μ µg 312.6 nmol); ตรวจสอบปริมาณ OD ที่วัดได้ด้วย spectrophotometer
2. Oligonucleotide 2 45.9 ส่งมอบ 9.04 OD (1 μ µg 279.7 nmol); ตรวจสอบปริมาณ OD ที่วัดได้ด้วย spectrophotometer
3. สารละลายสต็อก oligonucleotide แต่ละตัวต้องมีความเข้มข้นของ oligonucleotide ที่ต้องการ 2 เท่านั่นคือสารละลายแต่ละตัวต้องมีค่า 100 µM
   1. µL รับ oligonucleotide 1 ให้เพิ่ม 49.9 x 10 = 499 μ m ของ Annealing Buffer เพื่อสร้าง µM โซลูชันสต็อก 100 μ m
   2. µL รับ oligonucleotide 2 ให้เพิ่ม 45.9 x 10 = 459 μ m ของ Annealing Buffer เพื่อสร้าง µM โซลูชันสต็อก 100 μ m

* การคำนวณนี้เป็นทางลัดที่ใช้ได้เฉพาะในการสร้างโซลูชัน 100 µM และใช้ที่นี่เพื่อวัตถุประสงค์ตัวอย่างเท่านั้น หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการคำนวณความเข้มข้นของ oligonucleotide ที่แตกต่างกันโปรดดูที่ แนวทางการจัดการและความเสถียร

Oligo Annealing

บล็อกความร้อน

1. ผสม oligonucleotides ที่เท่ากันในไมโครหลอด
2. บ่มไมโครหลอดทดลองที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 5 นาที
3. ปล่อยให้ไมโครหลอดค่อยๆเย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง (< 60 นาที)

เทอร์โมไซเซอร์

แม้ว่าบล็อกความร้อนจะใช้งานได้แต่เทอร์โมไซเซอร์จะช่วยให้กระบวนการมีความสอดคล้องกันมากขึ้น

1. ผสมโอลิโกโนนิวคลีโอไทด์ที่เท่ากันในหลอด PCR
2. ใช้โปรไฟล์ความร้อนต่อไปนี้:
   1. ให้ความร้อนที่ 95°C และรักษาอุณหภูมิไว้เป็นเวลา 2 นาที
      
   2. เย็นถึง 25°C นานกว่า 45 นาที
      
   3. เย็นถึง 4°C สำหรับการจัดเก็บชั่วคราว
3. ปั่นเหวี่ยงหลอด PCR เป็นเวลาสั้นๆเพื่อดึงความชื้นทั้งหมดออกจากฝา

หลังจากการติดตั้งบล็อกความร้อนหรือเทอร์โมไซเซอร์ตอนนี้ oligonucleotide แบบดูเพล็กซ์พร้อมใช้งานหรือจัดเก็บแล้ว หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการจัดเก็บ Oligonucleotides โปรดดูที่ แนวทางการจัดการและความเสถียร

สูตรบัฟเฟอร์สำหรับการอบแห้งดีเอ็นเอและคำอธิบายของส่วนประกอบ

ทำบัฟเฟอร์ทั้งหมดด้วย น้ำ Milli-Q ®

องค์ประกอบบัฟเฟอร์การหลอมเหลว (1 เท่า)

สำหรับการอบดีเอ็นเอบัฟเฟอร์มักจะมีเกลือและสารทำให้เสถียรเพื่อให้แน่ใจว่าการผสมของ oligonucleotides จะดีที่สุด สูตรทั่วไปคือ:

• 10 มม. Tris-HCl (pH 7.5 - 8.0 - รักษาค่า pH ที่เสถียรสำหรับปฏิกิริยา
• NaCl ขนาด 50 มม. - ให้ความแข็งแรงของไอออนที่จำเป็นเพื่อส่งเสริมการผสมข้ามพันธุ์
• EDTA ขนาด 1 มม. – chelates divalent cations เพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยนิวเคลียส

ในการอบ oligos ให้ผสมเข้ากับบัฟเฟอร์นี้ให้ความร้อนถึง 95°C เป็นเวลา 2-5 นาทีจากนั้นค่อยๆเย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้องทำให้ oligos สามารถผสมเข้ากับ DNA ที่มีความเสถียรสองชั้น ทำบัฟเฟอร์ทั้งหมดด้วย น้ำ Milli-Q ® Type I

องค์ประกอบบัฟเฟอร์ของ Ligase (1 เท่า)

สูตรบัฟเฟอร์มาตรฐานของ ligase โดยทั่วไปจะประกอบด้วยส่วนประกอบต่อไปนี้:

• 50 มม. Tris-HCl (pH 7.5 - 8.0 - ให้สภาพแวดล้อม pH ที่มั่นคงสำหรับปฏิกิริยาการติด
• 10 มม. MgCling - เป็นปัจจัยสำคัญในการทำกิจกรรมของเอ็นเอ
• DTT 10 มม. (Dithiothreitol) - ช่วยรักษาสถานะที่ลดลงของเอนไซม์ ligase
• ATP 1 มม. –จำเป็นต้องใช้เป็นแหล่งพลังงานสำหรับกระบวนการควบ
• 25 ไมโครกรัม/มล. BSA (อุปกรณ์เสริม) – µg ให้เอนไซม์คงตัวในระหว่างการเกิดปฏิกิริยา

บัฟเฟอร์นี้สนับสนุนสภาวะการรวมที่เหมาะสมที่สุดทำให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอสามารถรวมเข้าด้วยกันได้อย่างมีประสิทธิภาพ

องค์ประกอบบัฟเฟอร์ไคเนส (1 เท่า)

สูตรบัฟเฟอร์ไคเนสทั่วไปประกอบด้วยส่วนประกอบต่อไปนี้:

• 50 มม. Tris-HCl (pH 7.5 –รักษาค่า pH ที่เหมาะสมสำหรับกิจกรรมไคเนส
• 10 มม. MgCling - ทำหน้าที่เป็นปัจจัยร่วมที่จำเป็นสำหรับการทำงานของไคเนส
• 5 มม. DTT (Dithiothreitol) –ช่วยให้เอนไซม์อยู่ในสถานะที่ใช้งานและลดลง
• ATP 1 มม. - ให้กลุ่มฟอสเฟตสำหรับปฏิกิริยาฟอสฟอรัส

บัฟเฟอร์นี้ช่วยให้มั่นใจได้ว่ามีฟอสฟอรัสที่มีประสิทธิภาพของพื้นผิวที่ใช้กันทั่วไปในปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับโพลีนิวคลีโอไทด์ไคเนส (PNK) เพื่อเพิ่มกลุ่มฟอสเฟตให้กับ DNA หรือ RNA สิ้นสุด

ข้อมูลอ้างอิง

1. Rychlik W, Spencer W, Rhoads R. 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplificationin vitro;. Nucl Acids Res. 18(21):6409-6412. https://doi.org/10.1093/nar/18.21.6409