หน้าแรก การประยุกต์ใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสทำงานกับ PCR

ทำงานกับ PCR

General Considerations

ปัจจัยที่ต้องพิจารณาใน RT-PCR

การป้องกันการปนเปื้อนของ Carryover
- ป้องกันการปนเปื้อนของ carryover ด้วย uracil-DNA glycosylase
- การป้องกันการปนเปื้อนจากการยกใน RT-PCR

การแก้ไขปัญหา

General Considerations

Setting up the Laboratory to Avoid Contamination

ความสามารถของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ในการขยายโมเลกุลเดียวหมายความว่าสารปนเปื้อนดีเอ็นเอจำนวนร่องรอยอาจทำหน้าที่เป็นแม่แบบซึ่งส่งผลให้เกิดการขยายแม่แบบที่ไม่ถูกต้อง (ผลบวกเท็จ) พิจารณาประเด็นที่กล่าวถึงด้านล่างเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน PCR จากแหล่งต่างๆเช่น:

ม้านั่งในห้องปฏิบัติการอุปกรณ์และอุปกรณ์ปิเปตต์ซึ่งอาจปนเปื้อนด้วยการเตรียมดีเอ็นเอก่อนหน้านี้โดยพลาสมิดดีเอ็นเอหรือโดยชิ้นส่วนข้อจำกัดบริสุทธิ์
การปนเปื้อนระหว่างตัวอย่าง
ผลิตภัณฑ์จากการขยาย PCR ก่อนหน้า

Laboratory Facilities

อย่างน้อยที่สุดให้ใช้สถานที่ทำงานที่แยกออกจากกันสำหรับ:
- การเตรียมแม่แบบก่อน PCR
- การตั้งค่าปฏิกิริยา PCR
- post-PCR analysis
ใช้หลอด PCR ที่มีผนังบางซึ่งปราศจาก DNase และ RNase
ใช้ ปิเปตต์ชนิดพิเศษ ที่ทนต่อละอองลอยและปิเปตต์เฉพาะ (ใช้เฉพาะสำหรับ PCR) ชุดปิเปตต์โดยเฉพาะปิเปตต์ชนิด Positive Displacement
หากเป็นไปได้ให้ตั้งค่าปฏิกิริยา PCR ภายใต้ควันดูดที่มีแสง UV จัดเก็บเครื่องปั่นแยกขนาดเล็กและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้งซึ่งใช้สำหรับ PCR ภายใต้เครื่องดูดควันเท่านั้น

การจัดการตัวอย่าง

ใช้เทคนิคปลอดเชื้อและสวมถุงมือใหม่เสมอเมื่อทำงานในบริเวณ PCR เปลี่ยนถุงมือบ่อยๆโดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าคุณสงสัยว่าถุงมือมีการปนเปื้อนด้วยสารละลายที่มีดีเอ็นเอเทมเพลต
ใช้เครื่องแก้วพลาสติกและปิเปตต์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อใหม่และ/หรือฆ่าเชื้อแล้วเพื่อเตรียมน้ำยา PCR และดีเอ็นเอเทมเพลตเสมอ
Autoclave น้ำยาและโซลูชั่นทั้งหมดที่สามารถ autoclaved โดยไม่ส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพของพวกเขา แน่นอนว่าไพรเมอร์ dNTPs และ Taq DNA Polymerase ไม่ควรถูกทำให้เป็นแบบอัตโนมัติ เตรียมชุดของตัวทำปฏิกิริยา PCR และสารละลายที่จะใช้เฉพาะใน PCR เก็บน้ำยาเหล่านี้ไว้ในอะลิควอทขนาดเล็ก
เมื่อทำการปิเปตต์ดีเอ็นเอให้หลีกเลี่ยงการสร้างละอองลอยที่อาจมีสารปนเปื้อน
รวมถึงปฏิกิริยาควบคุมเสมอตัวอย่างเช่นการควบคุมเชิงลบ (" ไม่มี DNA") ซึ่งมีส่วนประกอบของปฏิกิริยาทั้งหมดยกเว้นดีเอ็นเอเทมเพลตและการควบคุมเชิงบวกที่ใช้ใน PCR ก่อนหน้านี้

Special Equipment

Type of Thermal Cycler

นักปั่นจักรยานความร้อนจะต้องรักษาอุณหภูมิการบ่ม PCR ทั้งสามอย่างให้ถูกต้องและสามารถทำซ้ำได้ (ดู โปรไฟล์การปั่นจักรยานความร้อนสำหรับ PCR มาตรฐาน) เปลี่ยนจากอุณหภูมิหนึ่งไปเป็นอีกอุณหภูมิหนึ่ง (" ทางลาด ") ในช่วงเวลาที่กำหนดได้มาถึงอุณหภูมิที่เลือกโดยไม่มีความสำคัญมากเกินไปหรือต่ำกว่านั้น และวนรอบระหว่างอุณหภูมิซ้ำๆและทำซ้ำได้

เงื่อนไขการขี่จักรยานจะต้องได้รับการปรับขึ้นอยู่กับวงจรความร้อนที่เกี่ยวข้องหรือการผสมรองพื้น/เทมเพลต

Type of Reaction Tubes

หลอดปฏิกิริยามีผลต่ออัตราการถ่ายเทความร้อนจากไซโคลนความร้อนไปยังส่วนผสมของปฏิกิริยา ดังนั้นควรใช้หลอดปฏิกิริยาผนังบางที่ออกแบบมาสำหรับ PCR และพอดีกับหลุมของแบรนด์เฉพาะของไซโคลนความร้อนที่คุณใช้

องค์ประกอบปฏิกิริยา PCR

Template

คุณภาพของแม่แบบจะมีผลต่อผลลัพธ์ของ PCR ตัวอย่างเช่นอาร์เอ็นเอจำนวนมากในเทมเพลตดีเอ็นเอสามารถคีเลตมิลลิกรัม^{2 +} และลดผลผลิตของ PCR ได้ นอกจากนี้เทมเพลตการยึดอาจมีสารยับยั้งโพลิเมอร์ที่ลดประสิทธิภาพของปฏิกิริยา

หมายเหตุ: เพื่อให้ได้แม่แบบที่บริสุทธิ์ที่สุดให้ใช้ผลิตภัณฑ์ทำให้บริสุทธิ์ที่ออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อทำให้ดีเอ็นเอ บริสุทธิ์เช่นชุดเตรียมแม่แบบ PCR บริสุทธิ์สูง

ความสมบูรณ์ของแม่แบบก็มีความสำคัญเช่นกัน ดีเอ็นเอเทมเพลตควรมีน้ำหนักโมเลกุลสูง หากต้องการตรวจสอบขนาดและคุณภาพของ DNA ให้เรียกใช้ตัวอย่างบนเจล agarose เมื่อทดสอบเทมเพลตใหม่ให้รวมการควบคุมเชิงบวกกับไพรเมอร์ที่ขยายผลิตภัณฑ์ที่มีขนาดที่รู้จักและให้ผลผลิตที่ดี

ปริมาณเทมเพลตในปฏิกิริยาจะมีผลอย่างมากต่อประสิทธิภาพใน PCR ปริมาณเทมเพลตที่แนะนำสำหรับ PCR มาตรฐานคือ:

DNA จีโนมิกของมนุษย์สูงสุด 500 นาโนกรัม
ดีเอ็นเอแบคทีเรีย 1 – 10 นาโนกรัม
ดีเอ็นเอพลาสมิด 0.1 – 1 นาโนกรัม

เทมเพลตจำนวนน้อยตัวอย่างเช่น DNA จีโนมิกของมนุษย์ < 10 ng จะต้องมีการปรับเปลี่ยนปฏิกิริยาเฉพาะเช่นการเปลี่ยนแปลงจำนวนรอบการออกแบบใหม่ของไพรเมอร์การใช้ Hot Start ฯลฯ

ไพรเมอร์

ในการใช้งาน PCR ส่วนใหญ่จะเป็นลำดับและความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่กำหนดความสำเร็จในการวิเคราะห์โดยรวม เพื่อความสะดวกในการใช้งานมีโปรแกรมซอฟต์แวร์การออกแบบสีรองพื้นหลายโปรแกรม ซึ่งสามารถใช้เพื่อให้แน่ใจว่าลำดับไพรเมอร์มีลักษณะทั่วไปดังต่อไปนี้:

18 – 24 bases long
ไม่มีโครงสร้างรองภายใน
40 – 60% G/C
การกระจายที่สมดุลของโดเมนที่อุดมไปด้วย G/C และ A/T
ไม่สนับสนุนซึ่งกันและกันที่ปลาย 3 (ไพรเมอร์ - ดิมเมอร์จะไม่ก่อตัว)
อุณหภูมิหลอมเหลว (TM) ที่ช่วยให้อุณหภูมิหลอมเหลว +55 ถึง +65°C (สำหรับความจำเพาะสูงสุดให้ใช้อุณหภูมิ +62 ถึง +65°C)

อุณหภูมิการหลอมที่เหมาะสมมักจะสูงกว่า TM ของไพรเมอร์ (ประมาณ +5 ถึง +10°C) และต้องพิจารณาอย่างเป็นเชิงประจักษ์ สำหรับไพรเมอร์ทั้งสองตัว TM ควรมีลักษณะคล้ายกัน

ฐานที่ไม่ผสมกับเทมเพลตอาจถูกเพิ่มที่ท้าย 5 ของไพรเมอร์ (เช่น สำหรับการแนะนำไซต์การจำกัดในผลิตภัณฑ์การขยาย) ความเข้มข้นของไพรเมอร์ระหว่าง 0.1 ถึง 0.6 μ m โดยทั่วไปจะ µM ได้ดีที่สุด ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่สูงขึ้นอาจทำให้เกิดการล่อน้ำมันผิดพลาดและการสะสมของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่ต่ำกว่าอาจหมดลงก่อนที่ปฏิกิริยาจะเสร็จสมบูรณ์ส่งผลให้อัตราผลตอบแทนของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการลดลง

หมายเหตุ: สำหรับบางระบบความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่สูงขึ้น (สูงสุด 1 µM) อาจช่วยปรับปรุงผลลัพธ์ได้ เมื่อทดสอบไพรเมอร์ใหม่ให้รวมปฏิกิริยาการควบคุมเชิงบวกกับเทมเพลตที่ได้รับการทดสอบฟังก์ชันใน PCR เสมอ การควบคุมนี้จะแสดงว่าไพรเมอร์ทำงานหรือไม่ มนุษย์ Genomic DN Afrom Roche เป็นแม่แบบการควบคุมที่ดีสำหรับการประเมินลำดับไพรเมอร์ของมนุษย์

ทางเลือกของ DNA Polymerase

การเลือกดีเอ็นเอโพลิเมอร์สามารถส่งผลกระทบอย่างมากต่อผลลัพธ์ของ PCR สำหรับ PCR ที่ทำเป็นประจำส่วนใหญ่แล้ว Taq DNA Polymerase เป็นเอนไซม์ PCR มาตรฐานมานานแล้ว อย่างไรก็ตาม Taq DNA Polymerase มีข้อจำกัด สำหรับการวิเคราะห์ส่วนใหญ่ปริมาณดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่มีความร้อนที่เหมาะสม (หรือการผสมผสานของพอลิเมอเรส) จะอยู่ระหว่าง 0.5 และ 2.5 หน่วย/50 µL ปริมาณปฏิกิริยา บางครั้งความเข้มข้นของเอนไซม์ที่เพิ่มขึ้นอาจทำให้ความจำเพาะลดลง

ความเข้มข้น MgCl 2

MG^{2 +} สร้างคอมเพล็กซ์ที่ละลายน้ำได้ด้วย dNTP เพื่อผลิตพื้นผิวจริงที่พอลิเมอเรสรู้จัก ความเข้มข้นของมิลลิกรัมฟรี^{2 +} ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสารประกอบที่ผูกไอออนรวมทั้ง dntp, pyrophosphate ฟรี (PPI) และ EDTA เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุดให้กำหนดค่า ความเข้มข้นของ MG 2 + ที่เหมาะสมที่สุดในเชิงประจักษ์เสมอ ค่า ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ MG 2 ขึ้นไปอาจแตกต่างกันไปประมาณ 1 - 5 มม. ความเข้มข้นของ MG 2 + ที่ใช้กันมากที่สุดคือ 1 5 มม. (โดยมี dNTP ที่ความเข้มข้น 200 µM ต่อเครื่อง) MG^{2 +} มีอิทธิพลต่อกิจกรรมของเอนไซม์และเพิ่ม TM ของดีเอ็นเอสองสาย ส่วนเกิน mg^{2 +} ในปฏิกิริยาสามารถเพิ่มการผูกไพรเมอร์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงและเพิ่มพื้นหลังที่ไม่เฉพาะเจาะจงของปฏิกิริยา

Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) ความเข้มข้น

ใช้โซลูชันที่สมดุลของ dNTP ทั้งสี่เพื่อลดอัตราความผิดพลาดของพอลิเมอเรส ส่วนผสม dNTP ที่ไม่สมดุลจะลดความเที่ยงตรงของ Taq DNA Polymerase

หมายเหตุ: เพื่อความสะดวกสูงสุดส่วนผสมที่ผสมไว้ล่วงหน้าและสมดุลของ dNTP เช่น PCR nucleotide mi xmay จะถูกเพิ่มลงในส่วนผสมของปฏิกิริยาเป็นตัวทำปฏิกิริยาเดียว นอกจากนี้ยัง มี PCR grad edATP, DGTP, dCTP, DTT Pand ชุดไตรฟอสเฟต Deoxynucleoside เกรด PCR

หากคุณเพิ่มความเข้มข้นของ dNTP คุณต้องเพิ่ม ความเข้มข้นของ mg 2 + ด้วย ความเข้มข้นของ dNTP เพิ่มขึ้นช่วยลด mg^{2 + ฟรี}จึงรบกวนกิจกรรมของพอลิเมอเรสและลดการหลอมรองพื้น สำหรับการป้องกันการปนเปื้อนของ carryover มักจะใช้ความเข้มข้นสูงกว่า o fdUT Pis แทน dTTP (สำหรับรายละเอียดให้ดูที่ การป้องกันการปนเปื้อนของ carryover กับ uracil-DNA glycosylase) ความเข้มข้น dNTP สุดท้ายควรอยู่ที่ 50 – 500 µM (แต่ละ dNTP) ความเข้มข้นของ dNTP ที่ใช้กันมากที่สุดคือ 200 µM

ค่า pH

โดยทั่วไปค่า pH ของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่มาพร้อมกับพอลิเมอเรส DNA ที่มีความเสถียรต่ออุณหภูมิที่สอดคล้องกัน (pH 8.3 - 9.0 จะให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด อย่างไรก็ตามสำหรับบางระบบการเพิ่มค่า pH อาจทำให้แม่แบบมีความเสถียรและเพิ่มผลลัพธ์ได้

Reaction Additives

ในบางกรณีการเพิ่มสารประกอบต่อไปนี้สามารถเพิ่มประสิทธิภาพหรือความจำเพาะของ PCR:

เบทาอีน (ขนาด 0.5 – 2 ม.)
อัลบูมิน µL รัมวัว (BSA; 100 นาโนกรัม/50 ไมโครลิตร)
สารซักล้าง
dimethylsulfoxide (DMSO 2 - 10%) (v/v)
เจลาติน
กลีเซอรอล (1 – 5%) (v/v)
ไพโรฟอสฟาเทส (0.001 – 0.1 หน่วย/ปฏิกิริยา)
อสุจิ
โปรตีน T4 ยีน 32
สร้างความเปลี่ยนแปลง

โปรไฟล์การขี่จักรยานความร้อนสำหรับ PCR มาตรฐาน

การลดความอิ่มสีเบื้องต้น

มันเป็นสิ่งจำเป็นที่จะสร้างความแตกต่างของ DNA แม่แบบอย่างสมบูรณ์ ความร้อนเริ่มต้นของส่วนผสม PCR เป็นเวลา 2 นาทีที่ +94 ถึง +95°C เพียงพอที่จะทำให้ดีเอ็นเอพันธุกรรมที่ซับซ้อนสมบูรณ์เพื่อให้ไพรเมอร์สามารถหลอมเข้ากับเทมเพลตได้เนื่องจากการผสมปฏิกิริยาเย็นลง หากดีเอ็นเอเทมเพลตถูกตัดออกเพียงบางส่วนก็จะมีแนวโน้มที่จะ " ดีดกลับ " อย่างรวดเร็วป้องกันการหลอมและการขยายตัวของไพรเมอร์ที่มีประสิทธิภาพหรือนำไปสู่ " การเตรียมตัวเอง " ซึ่งอาจนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

ขั้นตอนการลดความอิ่มสีระหว่างการปั่นจักรยาน

การลดความอิ่มตัวที่ +94 ถึง +95°C เป็นเวลา 20 – 30 วินาทีโดยปกติแล้วจะเพียงพอแต่จะต้องปรับให้เหมาะกับวงจรความร้อนและท่อที่ใช้ ตัวอย่างเช่น µL เป็นต้องใช้เวลานานกว่าการลดความอิ่มตัวของสีในหลอดขนาด 500 μ m มากกว่าหลอดขนาด 200 μ m µL หากอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวต่ำเกินไป DNA ที่ละลายอย่างไม่สมบูรณ์ " สแนปแบ็ค " ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้จึงไม่สามารถเข้าถึงไพรเมอร์ได้ ใช้ระยะเวลาในการลดความอิ่มสีที่นานขึ้นหรืออุณหภูมิที่สูงขึ้นสำหรับ DNA เทมเพลตที่อุดมไปด้วย GC

หมายเหตุ: อย่าใช้เวลาในการลดความอิ่มสีนานเกินกว่าที่จำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการลดความอิ่มสีของดีเอ็นเอแม่แบบอย่างสมบูรณ์ เวลาการลดความอิ่มตัวที่ยาวนานโดยไม่จำเป็นจะลดกิจกรรมของ Taq DNA Polymerase

Primer Annealing

เพื่อวัตถุประสงค์ส่วนใหญ่อุณหภูมิการหลอมจะต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมในเชิงประจักษ์ การเลือกอุณหภูมิการหลอมรองพื้นอาจเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการออกแบบ PCR ที่มีความจำเพาะสูง ถ้าอุณหภูมิสูงเกินไปไม่มีการหลอมเกิดขึ้นแต่ถ้ามันต่ำเกินไปการหลอมที่ไม่เฉพาะเจาะจงจะเพิ่มขึ้นอย่างมาก ไพรเมอร์ - ดิมเมอร์จะเกิดขึ้นหากไพรเมอร์มีฐานเสริมหนึ่งฐานหรือมากกว่าเพื่อให้การจับคู่ฐานระหว่างปลาย 3 ของไพรเมอร์ทั้งสองสามารถเกิดขึ้นได้

Primer Extension

สำหรับชิ้นส่วนที่มีความยาวสูงสุด 3 kb โดยปกติแล้วจะมีการยืดสีรองพื้นที่ +72°C Taq DNA Polymerase สามารถเพิ่มฐานได้ประมาณ 60 ฐานต่อวินาทีที่ +72°C ส่วนขยาย 45 วินาทีเพียงพอสำหรับชิ้นส่วนที่มีความยาวไม่เกิน 1 kb สำหรับการต่อขยายของชิ้นส่วนได้ถึง 3 kb ให้รอประมาณ 45 วินาทีต่อ kb อย่างไรก็ตามเวลาเหล่านี้อาจต้องได้รับการปรับสำหรับเทมเพลตที่ระบุ เพื่อให้ได้ผลผลิตที่ดีขึ้นให้ใช้คุณสมบัติการต่อวงจรของไซเลอร์ระบายความร้อน ตัวอย่างเช่นทำ 10 รอบแรกที่เวลาต่อขยายคงที่ (เช่น45 วินาทีสำหรับผลิตภัณฑ์ 1 kb) จากนั้นสำหรับ 20 รอบถัดไปให้เพิ่มเวลาในการต่อขยาย 2 – 5 วินาทีต่อรอบ (เช่น50 วินาทีสำหรับรอบ 11 55 วินาทีสำหรับรอบ 12 ฯลฯ) การขยายวงจรช่วยให้เอนไซม์มีเวลาทำงานมากขึ้นเนื่องจาก PCR มีความคืบหน้ามีเทมเพลตมากขึ้นในการขยายและลดเอนไซม์ (เนื่องจากการลดความอิ่มตัวในระหว่างอุณหภูมิ PCR ที่สูงเป็นเวลานาน) เพื่อทำการขยาย

Cycle Number

ในปฏิกิริยาที่ดีที่สุดโมเลกุลแม่แบบน้อยกว่า 10 โมเลกุลสามารถขยายได้ในเวลาน้อยกว่า 40 รอบให้กับผลิตภัณฑ์ที่สามารถตรวจจับได้ง่ายบนเจลที่ย้อมด้วย ethidium bromide ดังนั้น PCR ส่วนใหญ่ควรจะมีเพียง 25 ถึง 35 รอบเท่านั้น เมื่อจำนวนรอบเพิ่มขึ้นผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงอาจสะสมได้ (รูปที่ 1)

รูปที่ 1ผลของการขี่จักรยานมากเกินไปบนแม่แบบที่บริสุทธิ์และบริสุทธิ์ ผลิตภัณฑ์ PCR (แอมพลิฟายเออร์ 245 bp จาก exon 6 ของยีนตัวรับ dopamine 2) ถูกขยายในชุดของปฏิกิริยา ในการทดลองชุดหนึ่งเทมเพลตไม่ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ก่อนที่จะถูกใช้งาน ในชุดที่สองเทมเพลตได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสเจล agarose ก่อนที่จะขยาย ในทั้งสองชุดเทมเพลตจะถูกขยายสำหรับ 40 60 หรือ 72 รอบ อะลิควอท (8 μ µL ของผลิตภัณฑ์ได้รับการวิเคราะห์บนเจล agarose 3 เปอร์เซ็นต์

MWM: เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล
40 60 และ 72: จำนวนรอบการขยาย

ผลลัพธ์: ในทั้งสองชุดจำนวนรอบต่ำสุด (40 รอบ) ได้ผลิตผลิตภัณฑ์ที่เฉพาะเจาะจงมากที่สุด ทั้งในการขยายวงจร 60 และ 72 รอยเปื้อนจะปรากฏขึ้นซึ่งมีผลิตภัณฑ์ PCR " เฉพาะ " แบบมัลติเมอร์
ถ่ายภาพโดยอภินันทนาการจาก U. Finckh และ A. Rollfs, Free University of Berlin, Germany

Final extension

โดยปกติแล้วหลังจากรอบสุดท้ายหลอดปฏิกิริยาจะจัดขึ้นที่ +72°C เป็นเวลา 5 - 15 นาทีเพื่อส่งเสริมการเสร็จสิ้นผลิตภัณฑ์เสริมบางส่วนและการหลอมผลิตภัณฑ์เสริมที่มีเกลียวเดี่ยว

คุณสมบัติของเอนไซม์ PCR

ตารางที่ 1 แสดงโปรไฟล์การใช้งานของเอนไซม์ PCR ที่ Roche จัดหาให้

ปัจจัยที่ต้องพิจารณาใน RT-PCR

การเลือกเอนไซม์ RT-PCR

เห็นได้ชัดว่าใน RT-PCR ปัจจัยสำคัญที่ต้องพิจารณาคือการเลือกใช้ reverse transcriptase เพื่อสังเคราะห์ cDNA เนื่องจากเอนไซม์ที่มีอยู่แต่ละชนิดมีคุณสมบัติเอนไซม์ที่แตกต่างกันจึงอาจเหมาะสำหรับการทดลองเฉพาะมากกว่าเอนไซม์อื่นๆ คุณสมบัติของเอนไซม์ที่สำคัญที่สุดจะกล่าวถึงด้านล่าง

Temperature Optima

อุณหภูมิในการบ่มที่สูงขึ้นสามารถช่วยขจัดปัญหาของโครงสร้างรองของแม่แบบได้ นอกจากนี้อุณหภูมิสูงยังช่วยเพิ่มความจำเพาะของการถอดสคริปต์แบบย้อนกลับโดยการลดการล่อน้ำมันที่ผิดพลาด ดังนั้นเทอร์โมแอคทีฟรีเวิร์สทรานสคริปต์ที่สามารถบ่มที่อุณหภูมิสูง (+50 ถึง 70°C) จึงมีแนวโน้มที่จะสร้างสำเนา mRNA ที่ถูกต้องมากขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งหากเทมเพลตมีเนื้อหา GC สูง

หมายเหตุ: ที่อุณหภูมิสูงเหล่านี้ให้ใช้เฉพาะไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงเท่านั้นห้ามใช้โอลิโก (DT) หรือไพรเมอร์ Hexamer แบบสุ่ม

ข้อกำหนดเกี่ยวกับไอออนที่ใช้ในการตรวจสอบ

ทรานสคริปท์การย้อนกลับส่วนใหญ่จำเป็นต้องใช้ไอออนสำหรับการดำเนินการ เอนไซม์ที่ใช้ MG^{2 +} มีแนวโน้มที่จะผลิตสำเนา cDNA ที่แม่นยำกว่าที่ใช้ Mn^{2 +}เนื่องจาก Mn^{2 +} ส่งผลเสียต่อความเที่ยงตรงของการสังเคราะห์ DNA

ความจำเพาะและความไว

การถอดสคริปต์ย้อนกลับมีความสามารถในการคัดลอกเทมเพลต (ความไว) จำนวนเล็กน้อยที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ยังมีความแตกต่างในความสามารถในการถอดความโครงสร้างรอง RNA ได้อย่างถูกต้อง (ความจำเพาะ)

Enzyme Profiles

ตารางที่ 2 แสดงโปรไฟล์การใช้เอนไซม์ RT-PCR และชุดยาที่ Roche จัดหาให้

Table 2.โปรไฟล์การใช้เอนไซม์ RT-PCR และชุดที่ Roche จัดหาให้

ตัวเลือกไพรเมอร์การถอดสคริปต์ย้อนกลับ

การล่อน้ำมันมีผลต่อขนาดและความจำเพาะของ cDNA ที่ผลิต มีไพรเมอร์สามประเภทที่สามารถใช้ในการถอดสคริปต์ย้อนกลับ:

oligo(DT) 12 – 18ซึ่งเชื่อมโยงกับหางภายนอก (A)+ ที่ปลายด้าน 3 ของ mammalian mRNA สีรองพื้นนี้มักจะสร้าง cDNA แบบเต็มความยาว
hexanucleotides แบบสุ่มซึ่งผูกกับ mRNA ในไซต์เสริมต่างๆและนำไปสู่ cDNAs ความยาวบางส่วน (สั้น) hexanucleotides แบบสุ่มอาจเหมาะสำหรับการเอาชนะความยากลำบากที่นำเสนอโดยโครงสร้างรองที่กว้างขวางในแม่แบบ ไพรเมอร์เหล่านี้อาจถอดความได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น 5 ภูมิภาคของ mRNA
ไพรเมอร์ oligonucleotide เฉพาะซึ่งคัดเลือกเฉพาะ mRNA ที่น่าสนใจ ไพรเมอร์ประเภทนี้ถูกใช้อย่างประสบความสำเร็จในการวิเคราะห์การวินิจฉัย

การเตรียมแม่แบบ RNA

RT-PCR ที่ประสบความสำเร็จต้องใช้แม่แบบ RNA ที่มีคุณภาพสูงและสมบูรณ์ ใช้แนวทางต่อไปนี้เพื่อช่วยเตรียมเทมเพลตนี้:

เพื่อลดการทำงานของ RNases ที่ถูกปล่อยออกมาในระหว่างการสลายเซลล์ให้รวม Protector RNase Inhibto Rin the lysis mix หรือใช้วิธีการที่รบกวนเซลล์และยับยั้ง RNases พร้อมกัน
ทำตามขั้นตอนเพื่อกำจัดแหล่งที่อาจเกิดการปนเปื้อน RNase ทั้งหมดจากเครื่องแก้วพลาสติกน้ำยาฯลฯ
ใช้ผลิตภัณฑ์ที่ออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับการทำให้บริสุทธิ์กรดนิวคลีอิกเพื่อเตรียมแม่แบบเริ่มต้น RNA เช่นผลิตภัณฑ์เตรียม RNA ที่ให้บริการโดย Roche
ใช้ mRNA ที่กรองแล้วเป็นเทมเพลตแทนที่จะใช้ RNA ทั้งหมด เริ่มต้นด้วย poly (A) + mRNA จะช่วยเพิ่มโอกาสในการขยาย mRNA ที่หายากได้อย่างมากเนื่องจากสัดส่วนของ mRNA ในการเตรียม RNA ทั้งหมดค่อนข้างต่ำ (โดยทั่วไปคือ 1 - 5% ของ RNA ทั้งหมดจากเซลล์เลี้ยงลูกด้วยนม)
หากใช้ mRNA เป็นแม่แบบให้ตรวจสอบความสมบูรณ์ของ mRNA โดยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสก่อนที่จะใช้ใน RT-PCR mRNA ควรปรากฏเป็นรอยเปื้อนระหว่างประมาณ 500 bp และ 8 kb mRNA ส่วนใหญ่ควรอยู่ระหว่าง 1.5 kb และ 2 kb

Primer design

การขยาย RT-PCR ของลำดับ mRNA เฉพาะจะต้องใช้ไพรเมอร์ PCR สองตัวที่มีเฉพาะสำหรับลำดับ mRNA นั้น การออกแบบสีรองพื้นควรช่วยให้สามารถแยกความแตกต่างระหว่างผลิตภัณฑ์ที่ขยายของ cDNA และผลิตภัณฑ์ที่ขยายได้จากการปนเปื้อน DNA จีโนมิก มีสองวิธีในการออกแบบไพรเมอร์ที่ต้องการ (รูปที่ 2)

รูปที่ 2แนวทางการออกแบบสีรองพื้น

Panel 1: ทำให้ไพรเมอร์ที่หลอมรวมกับลำดับใน exons ทั้งสองด้านของอินทรอน ด้วยไพรเมอร์เหล่านี้ผลิตภัณฑ์ใดๆที่ขยายจากดีเอ็นเอจีโนมิกจะมีขนาดใหญ่กว่าผลิตภัณฑ์ที่ขยายจาก mRNA ที่ไม่มีอินโทรนอล
Panel 2: ทำให้ไพรเมอร์ที่ขยายขอบเขต exon/exon บน mRNA ไพรเมอร์ดังกล่าวไม่ควรขยาย DNA จีโนมิก

ขั้นตอน RT-PCR

RT-PCR สามารถทำได้ทั้งแบบสองขั้นตอนหรือหนึ่งขั้นตอน แต่ละคนมีข้อดีบางอย่าง

1. ขั้นตอนสองขั้นตอน

A. สองหลอดขั้นตอนสองขั้นตอน

ในหลอดแรกการสังเคราะห์ cDNA แบบเกลียวเส้นแรกจะดำเนินการภายใต้สภาวะที่เหมาะสมโดยใช้นักทดสอบแบบสุ่ม, นักสีรองพื้น oligo(DT) (สร้างสระ cDNA) หรือไพรเมอร์เฉพาะลำดับ จากนั้นจะมีการถ่ายโอนอะลิควอทของปฏิกิริยา RT ไปยังหลอดอื่น (ที่มีโพลิเมอร์ DNA เทอร์โมสแตทบัฟเฟอร์โพลิเมอร์ดีเอ็นเอและไพรเมอร์ PCR) สำหรับ PCR

ข้อดีของวิธีการนี้: วิธีนี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการทดลองที่ต้องมีการวิเคราะห์การถอดเสียงหลายครั้งจากปฏิกิริยา RT เดียวกันหรือสำหรับแอปพลิเคชันเฉพาะเช่น Differential Display Reverse Transcription (DDRT) หรือ Rapid Amplification of cDNA Ends (RASE) นอกจากนี้เนื่องจากการตอบสนอง RT จะดำเนินการภายใต้สภาวะที่เหมาะสมวิธีนี้จะผลิตผลิตภัณฑ์ RT-PCR ที่ยาวที่สุด (ความยาวสูงสุด 14 kb หากใช้เอนไซม์ที่เหมาะสม)

B. หนึ่งหลอดขั้นตอนสองขั้นตอน

ในขั้นตอนแรก reverse transcriptase จะสร้าง cDNA แบบเส้นแรกเมื่อมี ไอออน MG 2 + ไอออนความเข้มข้นสูงของ dNTP และไพรเมอร์ [oligo(DT)] เฉพาะหรือไม่เฉพาะเจาะจง (ปริมาณปฏิกิริยา 20 µL) หลังจากปฏิกิริยา RT บัฟเฟอร์ PCR ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม (ไม่มี ไอออน mg 2 +) พอลิเมอเรส DNA ที่มีความร้อนและไพรเมอร์เฉพาะจะถูกเพิ่มลงในหลอดและ PCR จะดำเนินการ วิธีการนี้อาจมีประโยชน์เมื่อมีการจำกัดจำนวนเทมเพลตเนื่องจากมีการใช้ปฏิกิริยา RT ทั้งหมดใน PCR ถัดไป

ขั้นตอนสองขั้นตอนมีข้อดีดังต่อไปนี้:

ปรับสภาพการตอบสนองให้เหมาะสม รูปแบบสองขั้นตอนช่วยให้สามารถทำทั้งการถอดเสียงย้อนกลับและ PCR ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมเพื่อให้แน่ใจว่าการขยายเสียงมีประสิทธิภาพและถูกต้อง
ให้ความยืดหยุ่น ขั้นตอนสองขั้นตอนช่วยให้ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA เดียวที่จะใช้สำหรับการวิเคราะห์ใบรับรองผลการศึกษาหลาย ความยืดหยุ่นนี้มีประโยชน์สำหรับแอพพลิเคชันเฉพาะทางเช่นการขยายอย่างรวดเร็วของ cDNA Ends (RASE) และ Differential Display Reverse Transcription (DDRT)
ขยายลำดับแบบยาว ด้วยการผสมผสานที่ถูกต้องของ reverse transcriptase และ thermostable DNA polymerase RT-PCR แบบสองขั้นตอนสามารถขยายลำดับ RNA ได้ถึง 14 kb

2. หนึ่งหลอดขั้นตอนเดียว (คู่ RT-PCR)

ทั้งการสังเคราะห์ cDNA และการขยาย PCR จะดำเนินการด้วยบัฟเฟอร์และไพรเมอร์เฉพาะไซต์เดียวกันโดยไม่จำเป็นต้องเปิดหลอดปฏิกิริยาระหว่างขั้นตอน RT และ PCR นอกเหนือจากความไวที่สูงขึ้นของวิธีการนี้ (เช่นเดียวกับในหลอดหนึ่งปฏิกิริยาสองขั้นตอนข้างต้น) วิธีการหนึ่งขั้นตอนจะช่วยลดโอกาสของการปนเปื้อนเนื่องจากปฏิกิริยาทั้งหมดจะดำเนินการด้วยขั้นตอนการวางท่อน้อยที่สุดและไม่ต้องเปิดหลอด นอกจากนี้วิธีการนี้ยังช่วยให้สามารถวิเคราะห์ทรานสคริปท์เฉพาะได้โดยตรงเนื่องจากไพรเมอร์ที่ใช้ในทั้งสองขั้นตอนเป็นแบบเฉพาะลำดับ สุดท้ายทรานสคริปเทสย้อนกลับแบบเทอร์โมแอคทีฟที่ใช้ในขั้นตอนนี้ช่วยให้อุณหภูมิปฏิกิริยา RT สูง (+50 ถึง +72°C) ซึ่งช่วยลดการล่อน้ำมันผิดพลาดและเพิ่มความจำเพาะของปฏิกิริยาโดยการกำจัดโครงสร้าง mRNA รอง

ขั้นตอนหนึ่งขั้นตอนมีข้อดีดังต่อไปนี้:

ลดเวลาที่ต้องใช้ ปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวมีขั้นตอนการปิเปตต์น้อยกว่าปฏิกิริยาสองขั้นตอนซึ่งช่วยลดเวลาที่ต้องใช้ในการทำ RT-PCR และขจัดข้อผิดพลาดในการปิเปตต์
ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน ปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวทั้งหมดเกิดขึ้นในหลอดเดียวโดยไม่ต้องถ่ายโอนและไม่จำเป็นต้องเปิดหลอดปฏิกิริยา (ขั้นตอนที่สามารถเกิดการปนเปื้อนของตัวอย่าง PCR)
ปรับปรุงความไวและความจำเพาะของการสังเคราะห์ cDNA TW oCharacteristics ของปฏิกิริยาขั้นตอนเดียวให้ผลผลิตและประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้น: (1) ปฏิกิริยา cDNA จะดำเนินการที่อุณหภูมิสูง (เพื่อขจัดปัญหาเกี่ยวกับโครงสร้างรอง RNA) และ (1) ตัวอย่าง cDNA ทั้งหมดจะใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR 1 2

การป้องกันการปนเปื้อนของ Carryover

ป้องกันการปนเปื้อนของ Carryover ด้วย uracil-DNA Glycosylase

ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) สามารถขยายโมเลกุลเดียวเหนือพันล้าน ดังนั้นแม้ปริมาณสารปนเปื้อนเพียงเล็กน้อยก็สามารถขยายได้และส่งผลให้เกิดผลบวกที่ผิดพลาดได้ สารปนเปื้อนดังกล่าวมักเป็นผลิตภัณฑ์จากการขยาย PCR ก่อนหน้า (การปนเปื้อนจากการยกยอด) ดังนั้นนักวิจัยจึงได้พัฒนาวิธีการเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนดังกล่าว

กลยุทธ์ที่พบบ่อยอย่างหนึ่งคือการแทนที่ dUTP สำหรับ dTTP ในระหว่างการขยาย PCR เพื่อผลิตดีเอ็นเอที่มีสาร uracil (U-DNA) การรักษาส่วนผสมปฏิกิริยา PCR ที่ตามมาด้วย uracil-DNA Glycosylase (UNG) ก่อนที่จะมีการขยาย PCR และการแยกตัวของพอลิเมอร์นิวคลีโอไทด์ apyrimidinic ที่อุณหภูมิสูงขึ้น (+95°C) ภายใต้สภาวะด่าง (ในระหว่างขั้นตอนการลดความอิ่มตัวเริ่มต้น) จะลบการปนเปื้อน U-DNA ออกจากตัวอย่าง (รูปที่ 3 วิธีการนี้แน่นอนว่าต้องใช้ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดในห้องปฏิบัติการด้วย dUTP แทน dTTP

รูปที่ 3การกำจัดการปนเปื้อน U-DNA ด้วย uracil-DNA glycosylase

โปรดสังเกตสิ่งต่อไปนี้เมื่อใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มี DU ในการใช้งานปลายทาง:

ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มี DU จะมีผลเช่นเดียวกับผลิตภัณฑ์ที่มี DT เมื่อใช้เป็นเป้าหมายการผสมข้ามพันธุ์หรือเป็นแม่แบบสำหรับการจัดลำดับ Dideoxy
ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มี DU สามารถโคลนได้โดยตรงหากผลิตภัณฑ์เหล่านี้ถูกเปลี่ยนเป็นโฮสต์ของแบคทีเรียในปอด
สารตั้งต้นที่มีส่วนผสมของ DU จะถูกย่อยโดยเอนไซม์ควบคุมทั่วไป (เช่นEco RI และ Bam HI) ในขณะที่สารอื่นๆแสดงกิจกรรมที่ลดลง (เช่นhPa I, Hind II, Hind III) บนสารตั้งต้นเหล่านี้
เราไม่แนะนำให้ใช้ DNA ที่มี DU สำหรับการศึกษาโปรตีนที่มีผลผูกพันหรือการปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนดีเอ็นเอ

การป้องกันการปนเปื้อนของ Carryover ใน RT-PCR

มีสองวิธีในการป้องกันการปนเปื้อนของ carryover เมื่อขยาย RNA:

ใช้ หลอดเดียวขั้นตอน RT-PCR ขั้นตอนเดียว EtO จะลดจำนวนขั้นตอนการจัดการและการวางท่อและจำนวนครั้งที่ต้องเปิดหลอดปฏิกิริยา ซึ่งจะช่วยลดโอกาสที่จะเกิดการปนเปื้อนใน RT-PCR ได้
ทำ RT-PCR แบบขั้นตอนเดียวเมื่อมี dUTP เพื่อให้ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดมี DU และสามารถลบออกจาก PCR ที่ตามมาด้วย UNG ได้ (ดูที่ การป้องกันการปนเปื้อนของ Carryover ด้วย uracil-DNA Glycosylase) ซึ่งจะช่วยป้องกันการปนเปื้อนของสิ่งติดค้างใน PCR ถัดไป

การแก้ไขปัญหา

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางประการที่เราได้รวบรวมไว้เกี่ยวกับ PCR โดยอ้างอิงจากอาการที่พบบ่อยที่สุดห้าอาการที่พบ ก่อนที่คุณจะเริ่มต้นโปรดตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณได้ตรวจสอบคำแนะนำอื่นๆของแอปพลิเคชันแล้ว

ไม่มีผลิตภัณฑ์

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางประการที่เราได้รวบรวมไว้หาก PCR ของคุณไม่มีผลิตภัณฑ์

1. ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่ไม่เหมาะสม

ข้อเสนอแนะ: ไตเตรทความเข้มข้นของแมกนีเซียมโดยใช้ ชุดเพิ่มประสิทธิภาพ PCR ของเรา

2. ปริมาณเทมเพลตในการตอบสนองไม่เหมาะสม

จำนวนเทมเพลตที่จำเป็นจะแตกต่างกันไปตามปฏิกิริยาต่อปฏิกิริยา µL เป็นแนวทางให้ใช้ DNA ของมนุษย์ 100 - 750 นาโนกรัม (10 5 - 10 6 สำเนา) ต่อปฏิกิริยา 100 ไม รกรัม ปริมาณเอนไซม์ควรได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับแต่ละเทมเพลต

คำแนะนำ:

ไตเตรทปริมาณเทมเพลตในปฏิกิริยา
ทำการทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพที่แตกต่างกันความเข้มข้นของเอนไซม์โดยเพิ่มขึ้น 0.50 ครั้งในช่วงที่แนะนำ (0.5 ถึง 5 0 หน่วย)

3. มีตัวยับยั้งเอนไซม์ในปฏิกิริยา

สารยับยั้งที่ทราบของ PCR ประกอบด้วย:

แอมโมเนียมคลอไรด์ 50 มม
EDTA (เครื่องชุบโลหะ)
> 0.8 µM hematin
PBS (ฟอสเฟตจะผูกแมกนีเซียมฟรี)
> 0.02% sarcosyl
ยูเรีย 0.5 ม
> 5% DMF
> 10% formamide
เฮปาริน
> 20 PEG deoxycholate
> 0.01% SDS (สามารถย้อนกลับได้ด้วยอัตราส่วนโมลาร์เท่ากันของ NP40 และ Tween 20)
> 10% DMSO
> กลีเซอรอล 20%
> 0.4% N-octylglucoside
ฟีนอลตกค้าง
> โซเดียม deoxycholate 0.06%
ไพโรฟอสเฟต

ข้อเสนอแนะ: ลดหรือลบความเข้มข้นของสารยับยั้งใดๆในส่วนผสมของปฏิกิริยา

4. อุณหภูมิการหลอมรองพื้นสูงเกินไปหรือต่ำเกินไป

อุณหภูมิการหลอมรองพื้นโดยทั่วไปคือ +50 ถึง +60°C (อาจสูงกว่าหรือต่ำกว่าขึ้นอยู่กับลำดับรองพื้นและส่วนประกอบของบัฟเฟอร์)

ข้อเสนอแนะ: กำหนดอุณหภูมิ TM/หลอมขึ้นอยู่กับสมการต่อไปนี้:

หากไพรเมอร์เป็น 20-35 ฐาน
TP = 22 + 1.46 (LN) LN
= 2 (# G หรือ C) + (# A หรือ T)
TP = อุณหภูมิการหลอมที่มีประสิทธิภาพ ± 2 - 5

หากไพรเมอร์มีค่า 14 - 70 เบส
TM = 81.5 12 + 16.6 (log10 [J+]) + 0.41 (% G + C) - (0.5/l) - 0.063 (% Formamide) + 3 ถึง 600
[J+] = ความเข้มข้นของไอ
ออนบวกเดี่ยว l = ความยาวของ oligo

5. สีรองพื้นเสื่อมสภาพหรือไม่เหมาะสม

ไพรเมอร์ควรมีจำนวน A และ T เท่ากับ G และ C เท่ากันและควรมีอย่างน้อย 14 ฐานสำหรับความจำเพาะ

คำแนะนำ:

หากไพรเมอร์สั้นและ A-T รวยให้เพิ่ม DMSO 0.9 - 2.0% (v/v)
หากไพรเมอร์มีส่วนผสมของ G-C ให้เพิ่ม formamide 1 - 10% (v/v)
ตรวจสอบลำดับการล่อน้ำมันอีกครั้งใช้โปรแกรมการออกแบบรองพื้นหากมี
ตรวจสอบอะลิควอทของไพรเมอร์บนเจลเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการเสื่อมสภาพ

6. การย่อขนาดเทมเพลตไม่สมบูรณ์

ความร้อนที่ไม่เพียงพอในระหว่างขั้นตอนการลดความอิ่มตัวเป็นสาเหตุทั่วไปของความล้มเหลวในปฏิกิริยา PCR เป็นสิ่งสำคัญมากที่ปฏิกิริยาจะถึงอุณหภูมิที่เกิดการแยกเส้นใยอย่างสมบูรณ์ อุณหภูมิประมาณ +94°C เป็นเวลา 2 นาทีควรเพียงพอในกรณีส่วนใหญ่

ทันทีที่ตัวอย่างถึง +94°C สามารถระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิการหลอมได้ การลดความอิ่มตัวของสีอย่างมากอาจไม่จำเป็นและการสัมผัสกับอุณหภูมิที่สูงขึ้นอย่างจำกัดจะช่วยรักษากิจกรรมโพลิเมอร์สูงสุดตลอดการเกิดปฏิกิริยา

บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาดีเอ็นเอที่มีความเข้มข้นของมิลลิกรัมสูงกว่า (4 - 5 มม.) อาจต้องใช้อุณหภูมิการลดความอิ่มตัวที่สูงขึ้นเพื่อให้สามารถแยกเส้นเทมเพลตดีเอ็นเอได้อย่างสมบูรณ์ ขอแนะนำให้ใช้บัฟเฟอร์ที่ให้มาโดยไม่เพิ่มแมกนีเซียมเพิ่มเติม

คำแนะนำ:

เพิ่มอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวเริ่มต้นที่ +95 ถึง +97°C
ดีเอ็นเอความสูงลบเอนไซม์และบัฟเฟอร์เป็นเวลา 4 - 6 นาที
เพิ่มเวลาการลดความอิ่มตัวของการขี่จักรยาน 15 - 30 วินาที
Try Hot Start technique.
ดีเอ็นเอแบบวงปิดควรจะถูกแยกออกก่อน PCR วงกลมที่ไม่ได้ตัดจะทำให้เกิดการอิ่มตัวเร็วเกินไป

7. Machine-based error

คำแนะนำ:

ปรับเทียบบล็อกทำความร้อนและยืนยันอุณหภูมิจริงของบล็อก
เรียกใช้โปรแกรมการวินิจฉัยสำหรับเครื่องจักรเฉพาะ - ติดต่อผู้ผลิตเครื่องจักรสำหรับข้อมูลเฉพาะ

8. การไม่เหมาะสมเกิดจากโครงสร้างรองของเทมเพลตปลากะพงหรือโฮโมโลยีที่มากเกินไปที่ปลาย 3 ของไพรเมอร์

คำแนะนำ:

เพิ่มอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวเริ่มต้นที่ +95 ถึง +97°C
ดีเอ็นเอความสูงลบเอนไซม์และบัฟเฟอร์เป็นเวลา 4 - 6 นาที
เพิ่มเวลาการลดความอิ่มตัวของการขี่จักรยาน 15 - 30 วินาที
Try Hot Start technique.
เพิ่ม T4 ยีน 32 โปรตีน 3 - 5 ไม µL รกรัม/มล.
เมื่อออกแบบไพรเมอร์ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฐานมากกว่า 2 แห่งในการ homology ที่ปลายปี 3 ใช้โปรแกรมการออกแบบสีรองพื้นหากมี
พิจารณาการเพิ่มตัวทำละลายร่วมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา:
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% formamide
- ไกลคอลชนิดโพลีเอทิลีน 5 - 15%
- กลีเซอรอล 10 - 15%

9. ความเข้มข้น NaCl สูงกว่า 50 มม

คำแนะนำ: ลดความเข้มข้นของ NaCl

10. ความเข้มข้น KCL สูงกว่า 50 มม

คำแนะนำ: ลดความเข้มข้นของ KCL

การรวมตัวกันผิดหรือความไม่ซื่อสัตย์ต่ำ

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางอย่างที่เราได้รวบรวมไว้เกี่ยวกับการรวมตัวกันผิดหรือความเที่ยงตรงต่ำของปฏิกิริยา PCR

1. ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่ไม่เหมาะสม

ข้อเสนอแนะ: ไตเตรทความเข้มข้นของแมกนีเซียมโดยใช้ PCR Optimization KIT ของเรา

2. ความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์สูงเกินไปหรือไม่สมดุล

ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 20 - 200 µM ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว

คำแนะนำ:

ตรวจสอบความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด
ตรวจสอบความเข้มข้นสุดท้ายของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดอีกครั้ง

3. ค่า pH ของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาสูงเกินไป

ค่า pH 8.3 เป็นค่าที่เหมาะสมที่สุด

คำแนะนำ:

pH ของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาสามารถลดลงได้ถึง 5 - 6
การเปลี่ยนแปลงการทดแทนฐานลดลงหกเท่าและการเปลี่ยนแปลงการเปลี่ยนเฟรมลดลงโดยการยกระดับด้วยการลดค่า pH 3 หน่วย

4. การไม่เหมาะสมเกิดจากโครงสร้างรองของเทมเพลตปลากะพงหรือโฮโมโลยีที่มากเกินไปที่ปลาย 3 ของไพรเมอร์

คำแนะนำ:

เพิ่มอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวเริ่มต้นที่ +95 ถึง +97°C
ดีเอ็นเอความสูงลบเอนไซม์และบัฟเฟอร์เป็นเวลา 4 - 6 นาที
เพิ่มเวลาการลดความอิ่มตัวของการขี่จักรยาน 15 - 30 วินาที
Try Hot Start technique.
เพิ่ม T4 ยีน 32 โปรตีน 3 - 5 ไม µL รกรัม/มล.
เมื่อออกแบบไพรเมอร์ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฐานมากกว่า 2 แห่งในการ homology ที่ปลายปี 3 ใช้โปรแกรมการออกแบบสีรองพื้นหากมี
พิจารณาการเพิ่มตัวทำละลายร่วมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา:
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% formamide
- ไกลคอลชนิดโพลีเอทิลีน 5 - 15%
- กลีเซอรอล 10 - 15%

5. ดีเอ็นเอเทมเพลตเสียหาย

คำแนะนำ:

ลดจำนวนรอบเนื่องจากการทำความร้อน/ทำความเย็นซ้ำที่ pH สูงอาจทำให้แม่แบบเสียหาย (แม่แบบส่วนใหญ่ต้องใช้ 25 - 35 รอบ)
ตรวจสอบความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอของแม่แบบ
ลดเวลาการขี่จักรยานลงเหลือ 15 - 30 วินาที

วงที่ไม่เฉพาะเจาะจง

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางอย่างที่เราได้รวบรวมไว้เกี่ยวกับแถบที่ไม่เฉพาะเจาะจงหลังจากเกิดปฏิกิริยา PCR

1. ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่ไม่เหมาะสม

ข้อเสนอแนะ: ไตเตรทความเข้มข้นของแมกนีเซียมโดยใช้ชุดเพิ่มประสิทธิภาพ PCR ของเรา

2. ความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์สูงเกินไปหรือไม่สมดุล

ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 20 - 200 µM ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว

คำแนะนำ:

ตรวจสอบความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด
ตรวจสอบความเข้มข้นสุดท้ายของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดอีกครั้ง

3. การปนเปื้อน/การสะสมของดีเอ็นเอ

คำแนะนำ:

ทดสอบการยกยอดโดยทำ PCR โดยไม่เพิ่มดีเอ็นเอเป้าหมาย
หลีกเลี่ยงการยกยอด (ดูด้านล่าง)

ในการป้องกันการยกยอดให้ใช้วิธีปฏิบัติในห้องปฏิบัติการที่ดี:

แยกทางกายภาพการเตรียม PCR และผลิตภัณฑ์
โซลูชัน Autoclave เคล็ดลับและหลอด
แบ่งตัวทำปฏิกิริยาเพื่อลดการสุ่มตัวอย่างซ้ำ (ไม่เกิน 20 ปฏิกิริยาต่ออะลิควอท)
กำจัดละอองลอยโดยใช้ปิเปตต์ชนิด Positive Displacement
Premix reagents
เพิ่มดีเอ็นเอให้กับการตอบสนองเป็นอันดับสุดท้าย
เลือกการควบคุมเชิงบวกและลบอย่างระมัดระวัง
แช่กล่องเจลและหวีใน 1 M HCl เพื่อกำจัดดีเอ็นเอ
ใช้ใบมีดโกนใหม่เพื่อเพิ่มความโดดเด่นให้กับแถบ
ปิดกล่อง UV ด้วยพลาสติกห่อสด
ใช้น้ำมันซ้อนทับเสมอ

ในการขจัดการปนเปื้อน/การยกยอด:

ผสมส่วนประกอบทั้งหมดเข้าด้วยกันยกเว้นเท็มเพลต DNA ฉายรังสีในหลอดโพลีโพรพิลีนขนาด 0.5 มล. ที่ใสโดยสัมผัสกับตัวส่องผ่านกระจกโดยตรง (หลอด UV ขนาด 254 และ 300 nm) เป็นเวลา 5 นาที
การย่อยอาหาร Ung: รวม dUTP nucleotides เข้าไปในปฏิกิริยาและทำการย่อยอาหาร uracyl DNA glycosylase ตามมา

4. อุณหภูมิการอบอ่อนของไพรเมอร์ต่ำเกินไป

ข้อเสนอแนะ: กำหนดอุณหภูมิ TM/หลอมขึ้นอยู่กับสมการต่อไปนี้:

5. การไม่เหมาะสมเกิดจากโครงสร้างรองของเทมเพลตปลากะพงหรือโฮโมโลยีที่มากเกินไปที่ปลาย 3 ของไพรเมอร์

คำแนะนำ:

เพิ่มอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวเริ่มต้นที่ +95 ถึง +97°C
ดีเอ็นเอความสูงลบเอนไซม์และบัฟเฟอร์เป็นเวลา 4 - 6 นาที
เพิ่มเวลาการลดความอิ่มตัวของการขี่จักรยาน 15 - 30 วินาที
Try Hot Start technique.
เพิ่ม T4 ยีน 32 โปรตีน 3 - 5 ไม µL รกรัม/มล.
เมื่อออกแบบไพรเมอร์ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฐานมากกว่า 2 แห่งในการ homology ที่ปลายปี 3 ใช้โปรแกรมการออกแบบสีรองพื้นหากมี
พิจารณาการเพิ่มตัวทำละลายร่วมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา:
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% formamide
- ไกลคอลชนิดโพลีเอทิลีน 5 - 15%
- กลีเซอรอล 10 - 15%

6. สีรองพื้นเสื่อมสภาพหรือไม่เหมาะสม

คำแนะนำ:

หากไพรเมอร์สั้นและ A-T รวยให้เพิ่ม DMSO 0.9 - 2.0% (v/v)
หากไพรเมอร์มีส่วนผสมของ G-C ให้เพิ่ม formamide 1 - 10% (v/v)
ตรวจสอบลำดับการล่อน้ำมันอีกครั้งใช้โปรแกรมการออกแบบรองพื้นหากมี
ตรวจสอบอะลิควอทของไพรเมอร์บนเจลเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการเสื่อมสภาพ

7. ความเข้มข้นของไพรเมอร์สูงเกินไป

ข้อเสนอแนะ: ปรับความเข้มข้นของสีรองพื้น (0.1 - 1.0 µM ของสีรองพื้นแต่ละตัวเหมาะสมที่สุด)

8. หมายเลขรอบสูงเกินไป

เทมเพลตส่วนใหญ่ต้องใช้ 25 - 30 รอบ

คำแนะนำ: หมายเลขรอบควรขึ้นอยู่กับความเข้มข้นเริ่มต้นของดีเอ็นเอแม่แบบ

ถ้าจำนวนโมเลกุลเป้าหมายในตัวอย่างของคุณคือ...	Then we recommend the following number of cycles...
3 x 10⁵	25 - 30
1.5 x 10⁴	30 - 35
1.0 x 10³	35 - 40
50	40 - 45

9. เทมเพลตต่ออัตราส่วนเอนไซม์ไม่ถูกต้อง

คำแนะนำ:

ไตเตรทปริมาณเทมเพลตในปฏิกิริยา
ทำการทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพที่แตกต่างกันความเข้มข้นของเอนไซม์โดยเพิ่มขึ้น 0.50 ครั้งในช่วงที่แนะนำ (0.5 ถึง 5 0 หน่วย)

สายรัดข้อมือที่เปื้อนแล้ว

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางประการที่เราได้รวบรวมไว้เกี่ยวกับแถบที่เปื้อนหลังจากปฏิกิริยา PCR

1. ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่ไม่เหมาะสม

ข้อเสนอแนะ: ไตเตรทความเข้มข้นของแมกนีเซียมโดยใช้ชุดเพิ่มประสิทธิภาพ PCR ของเรา

2. ความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์สูงเกินไปหรือไม่สมดุล

ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 20 - 200 µM ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว

คำแนะนำ:

ตรวจสอบความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด
ตรวจสอบความเข้มข้นสุดท้ายของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดอีกครั้ง

3. การปนเปื้อน/การสะสมของดีเอ็นเอ

คำแนะนำ:

ทดสอบการยกยอดโดยทำ PCR โดยไม่เพิ่มดีเอ็นเอเป้าหมาย
หลีกเลี่ยงการยกยอด (ดูด้านล่าง)

ในการป้องกันการยกยอดให้ใช้วิธีปฏิบัติในห้องปฏิบัติการที่ดี:

แยกทางกายภาพการเตรียม PCR และผลิตภัณฑ์
โซลูชัน Autoclave เคล็ดลับและหลอด
แบ่งตัวทำปฏิกิริยาเพื่อลดการสุ่มตัวอย่างซ้ำ (ไม่เกิน 20 ปฏิกิริยาต่ออะลิควอท)
กำจัดละอองลอยโดยใช้ปิเปตต์ชนิด Positive Displacement
Premix reagents
เพิ่มดีเอ็นเอให้กับการตอบสนองเป็นอันดับสุดท้าย
เลือกการควบคุมเชิงบวกและลบอย่างระมัดระวัง
แช่กล่องเจลและหวีใน 1 M HCl เพื่อกำจัดดีเอ็นเอ
ใช้ใบมีดโกนใหม่เพื่อเพิ่มความโดดเด่นให้กับแถบ
ปิดกล่อง UV ด้วยพลาสติกห่อสด
ใช้น้ำมันซ้อนทับเสมอ

ในการขจัดการปนเปื้อน/การยกยอด:

ผสมส่วนประกอบทั้งหมดเข้าด้วยกันยกเว้นเท็มเพลต DNA ฉายรังสีในหลอดโพลีโพรพิลีนขนาด 0.5 มล. ที่ใสโดยสัมผัสกับตัวส่องผ่านกระจกโดยตรง (หลอด UV ขนาด 254 และ 300 nm) เป็นเวลา 5 นาที
การย่อยอาหาร Ung: รวม dUTP nucleotides เข้าไปในปฏิกิริยาและทำการย่อยอาหาร uracyl DNA glycosylase ตามมา

4. อุณหภูมิการอบอ่อนของไพรเมอร์ต่ำเกินไป

ข้อเสนอแนะ: กำหนดอุณหภูมิ TM/หลอมขึ้นอยู่กับสมการต่อไปนี้:

คำแนะนำ:

เพิ่มอุณหภูมิการลดความอิ่มตัวเริ่มต้นที่ +95 ถึง +97°C
ดีเอ็นเอความสูงลบเอนไซม์และบัฟเฟอร์เป็นเวลา 4 - 6 นาที
เพิ่มเวลาการลดความอิ่มตัวของการขี่จักรยาน 15 - 30 วินาที
Try Hot Start technique.
เพิ่ม T4 ยีน 32 โปรตีน 3 - 5 ไม µL รกรัม/มล.
เมื่อออกแบบไพรเมอร์ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฐานมากกว่า 2 แห่งในการ homology ที่ปลายปี 3 ใช้โปรแกรมการออกแบบสีรองพื้นหากมี
พิจารณาการเพิ่มตัวทำละลายร่วมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา:
- 3 - 15% DMSO
- 1 - 10% formamide
- ไกลคอลชนิดโพลีเอทิลีน 5 - 15%
- กลีเซอรอล 10 - 15%

6. กิจกรรม DNase (ระบุโดยรอยเปื้อนที่มองเห็นได้บนเจลที่มีขนาดใต้แถบคาด)

คำแนะนำ:

สร้างโซลูชันสินค้าคงคลังใหม่
ตรวจสอบความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอของแม่แบบ

7. การปนเปื้อนน้ำมันของตัวอย่างเจล

คำแนะนำ:หมุนหลอดปฏิกิริยาและค่อยๆแยกชั้นน้ำมันออกจากพื้นผิว

8. เทมเพลตต่ออัตราส่วนเอนไซม์ไม่ถูกต้อง

คำแนะนำ:

ไตเตรทปริมาณเทมเพลตในปฏิกิริยา
ทำการทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพที่แตกต่างกันความเข้มข้นของเอนไซม์โดยเพิ่มขึ้น 0.50 ครั้งในช่วงที่แนะนำ (0.5 ถึง 5 0 หน่วย)

Low Yield

ต่อไปนี้เป็นคำแนะนำในการแก้ไขปัญหาบางประการที่เราได้รวบรวมไว้เกี่ยวกับอัตราผลตอบแทนที่ต่ำหลังจากปฏิกิริยา PCR

1. อุณหภูมิการหลอมรองพื้นสูงเกินไป

ข้อเสนอแนะ: กำหนดอุณหภูมิ TM/หลอมขึ้นอยู่กับสมการต่อไปนี้:

2. เทมเพลตไม่สะอาดหรือมีประสิทธิภาพลดลง

ตัวอย่างเช่นการปนเปื้อนโปรตีเอสอาจทำให้โพลิเมอร์เสื่อมสภาพได้

คำแนะนำ:

Try Hot Start technique.
ทำให้เทมเพลต DNA สะอาดบริสุทธิ์ที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้รวมถึงโปรตีอิเนสเคไดเจสต์

3. มีตัวยับยั้งเอนไซม์ในปฏิกิริยา

สารยับยั้งที่ทราบของ PCR ประกอบด้วย:

แอมโมเนียมคลอไรด์ 50 มม
EDTA (เครื่องชุบโลหะ)
> 0.8 µM hematin
PBS (ฟอสเฟตจะผูกแมกนีเซียมฟรี)
> 0.02% sarcosyl
ยูเรีย 0.5 ม
> 5% DMF
> 10% formamide
เฮปาริน
> 20 PEG deoxycholate
> 0.01% SDS (สามารถย้อนกลับได้ด้วยอัตราส่วนโมลาร์เท่ากันของ NP40 และ Tween 20)
> 10% DMSO
> กลีเซอรอล 20%
> 0.4% N-octylglucoside
ฟีนอลตกค้าง
> โซเดียม deoxycholate 0.06%
ไพโรฟอสเฟต

4. มีเทมเพลตไม่เพียงพอในการตอบสนอง

คำแนะนำ:

ไตเตรทปริมาณเทมเพลตในปฏิกิริยา
ทำการทดสอบการเพิ่มประสิทธิภาพที่แตกต่างกันความเข้มข้นของเอนไซม์โดยเพิ่มขึ้น 0.50 ครั้งในช่วงที่แนะนำ (0.5 ถึง 5 0 หน่วย)

5. อุณหภูมิส่วนขยายสูงเกินไป

อุณหภูมิและเวลาต่อขยายที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับขนาดของชิ้นส่วน:

+72°C เป็นเวลา 20 วินาทีสำหรับชิ้นส่วน <500 bp
+72°C เป็นเวลา 40 วินาทีสำหรับชิ้นส่วน 1.2 bp

คำแนะนำ: ควรใช้เวลานานกว่านั้นไม่ควรใช้อุณหภูมิสูงกว่านี้เมื่อมีแม่แบบที่ยาวกว่าหรือมีโครงสร้างรองที่น่าสงสัย

6. Enzyme activity is low

สำหรับโพลีเมอร์ของบริษัทโรชกิจกรรม 100% จะได้รับการรับประกันตลอดวันที่ควบคุม

คำแนะนำ:

ตรวจสอบวันที่ควบคุม หากจำเป็นให้รับเอนไซม์สด
ลองใช้เทคนิค Hot Start เพื่อช่วยรักษากิจกรรมผ่านการปั่นจักรยานด้วยความร้อน

7. หมายเลขรอบสูงเกินไป

เทมเพลตส่วนใหญ่ต้องใช้ 25 - 30 รอบ

ถ้าจำนวนโมเลกุลเป้าหมายในตัวอย่างของคุณคือ...	Then we recommend the following number of cycles...
3 x 10⁵	25 - 30
1.5 x 10⁴	30 - 35
1.0 x 10³	35 - 40
50	40 - 45

8. นิวคลีโอไทด์ไฮโดรไลซ์

ควรเก็บสารละลายของนิวคลีโอไทด์ไว้ที่ความเข้มข้นอย่างน้อย 10 มม. 100 มม. การย่อยสลายอย่างมีนัยสำคัญเกิดขึ้นหลังจากเก็บไว้ที่ 1 มม. เป็นเวลา 2 เดือน

ละลาย NTP หรือ dNTP ในน้ำที่ความเข้มข้นที่คาดว่าจะ 10 มม. ใช้กระดาษทริสเบสและกระดาษ pH 0.05 M ปรับค่า pH เป็น 7.0 เจือจางอะลิควอทของ NTP หรือ dNTP ที่เป็นกลางอย่างเหมาะสมและอ่านความหนาแน่นของแสงที่ความยาวคลื่นที่ระบุไว้ในตารางต่อไปนี้ คำนวณความเข้มข้นจริงโดยใช้ค่าสำหรับสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ แช่แข็งในอะลิควอทขนาดเล็กที่อุณหภูมิ -20°C

เบส	ความยาวคลื่น	ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์สำหรับฐาน e (M^- 1 ซม.^-1)
ก	259	1.54 x 10⁴
ความหนา	260	7.4 x 10³
G	253	1.37 x 10⁴
ค	271	9.1 x 10³
U	262	1.0 x 10⁴

เกลือลิเธียมและโซเดียมมีความเสถียรเทียบเท่ากันและทำงานได้ดีใน PCR, การจัดลำดับและการติดฉลาก เกลือลิเธียมสามารถละลายได้ในเอทานอลมากกว่าเกลือโซเดียม ดังนั้นการกำจัดเกลือลิเธียมโดยการตกตะกอนเอทานอลจึงมีประสิทธิภาพมากกว่าการกำจัดเกลือโซเดียม การใช้การเตรียมเกลือลิเธียมนิวคลีโอไทด์ช่วยลดสิ่งแปลกปลอมที่เกิดจากเกลือและเพิ่มความสามารถในการอ่านออกเสียงของเจลจัดลำดับ

9. ความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์สูงเกินไปหรือไม่สมดุล

ความเข้มข้นมาตรฐานคือ 20 - 200 µM ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว

คำแนะนำ:

ตรวจสอบความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด
ตรวจสอบความเข้มข้นสุดท้ายของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดอีกครั้ง

10. ความเข้มข้นของไพรเมอร์ต่ำเกินไป

คำแนะนำ: ปรับความเข้มข้นของสีรองพื้น (µM 0.1 - 1.0 μ m ของสีรองพื้นแต่ละตัวเหมาะสมที่สุด)

11. Machine-based error

คำแนะนำ:

ปรับเทียบบล็อกทำความร้อนและยืนยันอุณหภูมิจริงของบล็อก
เรียกใช้โปรแกรมการวินิจฉัยสำหรับเครื่องจักรเฉพาะ - ติดต่อผู้ผลิตเครื่องจักรสำหรับข้อมูลเฉพาะ

12. เอฟเฟ็กต์ที่ราบสูง

สาเหตุที่เป็นไปได้ของผลกระทบที่ราบสูง/การแก้ปัญหา:

การใช้ประโยชน์จากความเข้มข้นของ dNTP - dNTP ควรเป็น 20 - 200 µM แต่ละ
สิ้นสุดการยับยั้ง pyrophosphate ของผลิตภัณฑ์ - ลดจำนวนรอบเป็น 20 - 35 เพื่อลดการก่อตัวของ pyrophosphate
การลดความอิ่มตัวที่ไม่สมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์ที่ความเข้มข้นสูง - ใช้การขี่จักรยานตามขั้นตอนเพิ่มเวลาในการลดความอิ่มตัวในรอบต่อมา
ซับสเตรตที่เกินในอัตราส่วนซับสเตรต/เอนไซม์ - ใช้การปั่นจักรยานตามขั้นเพิ่มเวลาในรอบถัดไปหรือความเข้มข้นของเอนไซม์

13. การระเหย

การระเหยสามารถทำให้ส่วนประกอบมีความเข้มข้นสูงขึ้นซึ่งอาจยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ การเปลี่ยนแปลงของปริมาตรยังนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในโปรไฟล์ความร้อนภายในหลอดปฏิกิริยา

คำแนะนำ: ใช้ 100 µL น้ำมันแร่ซ้อนทับ/ปฏิกิริยา