DNA定量の精度・下流酵素プロセスに対するGenElute™-E精製法の影響

• DNA抽出および精製法
• 核酸調製中に導入される不純物の評価
  • 紫外（UV）分光測定による定量への干渉
  • ゲル電気泳動により評価した断片化DNAおよび低分子量核酸不純物
  • qPCRにおける干渉
• 結論

従来のスピンカラムに基づくDNA/RNA精製法では、シリカメンブレンカラムを使用して、細胞、組織、血液、その他のタイプのサンプルから核酸を分離します。塩酸グアニジンなどのカオトロピック塩を高濃度で用いて、DNAまたはRNAをシリカに結合させます。核酸を結合させた後、塩/エタノール溶液でシリカカラムを洗浄し、サンプルから他の生体分子を除去します。最後に、精製したDNAまたはRNAをTris溶出バッファーまたは水でカラムから溶出させます。

このような結合-洗浄-溶出法は面倒であり、複数回の洗浄・遠心ステップが必要です。遠心ステップを繰り返すことで、DNAが大幅に切断される可能性があります。また、カオトロピック塩やその他の夾雑物が、溶出されたDNAまたはRNAに混入しやすいことから、最終的な純度や定量、さらにはPCRなどの下流の酵素プロセスに影響を与える可能性があります。

メルクは、高濃度の塩結合とエタノール洗浄ステップの必要性をなくした、新しいsingle spin核酸精製システムを評価しました。GenElute™-E DNA/RNA精製キットは、サイズ排除に基づくネガティブクロマトグラフィー法を用いて、細胞、組織、血液、その他のサンプル中の大型のDNA/RNA核酸分子を、小型のタンパク質、脂質、イオン成分から分離します（図1～2）。

図1. ネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）技術を用いた核酸の精製。

図2. GenElute™-E Single Spin Blood DNA High Yieldキットとマウス血液サンプルを使用した、精製したDNAの溶出およびタンパク質、脂質、その他の分子の保持。A）精製したゲノムDNAの吸収スペクトル（赤線）。B）GenElute™-Eスピンカラム保持液の吸収スペクトル（黒線）と精製したDNAのスペクトル（赤）の重ね書き。保持液のスペクトルは、OD約280nmまたは≤240nmのタンパク質およびその他の汚染物質を示します。y軸のスケールを変更していることに注意してください。

メルクは、定量および下流の酵素プロセスを妨げる不純物に対する核酸精製方法の影響を評価しました。これらの比較研究のため、GenElute™-E single-spin精製法または供給業者Xの従来のシリカベースの結合-洗浄-溶出のスピンプレップ法を用いてゲノムDNAを調製しました。核酸純度は3つの方法を用いて評価しました。

• UV分光測定（A_260nm/_280nmおよびA_260nm/_230nmで測定した光学密度比）
• ゲル電気泳動
• 定量PCR（qPCR）

結果から、GenElute™-E single-spin DNA/RNA精製システムでは現行のシリカスピンプレップ法よりも高い純度が得られ、より正確な定量が可能で、PCRなどの下流の酵素プロセスにおける夾雑物による干渉が減少することが示されました。

核酸調製中に導入される不純物の評価

紫外（UV）分光測定による定量への干渉

タンパク質、断片化した核酸、ssDNA、RNA（DNAを測定する場合）、プライマー、抽出・精製プロトコル由来のカオトロピック塩などの一般的な生物学的汚染物質があると、核酸濃度が過大評価される可能性があります。これらの不純物の一部は、紫外（UV）分光測定で測定できます。この方法では、精製したDNAまたはRNAサンプルにUV光を通過させます。さまざまな波長でサンプルの吸光度を測定します。

260 nm（A₂₆₀）の吸光度は、核酸の測定に使用します。280 nm（A₂₈₀）の吸光度は、サンプル中の汚染タンパク質の測定に使用します。A₂₆₀/_A280 比は、タンパク質夾雑物に関するサンプルの純度の評価に使用できます。高純度のDNAのA₂₆₀/A₂₈₀比は1.8以上です。比率が低い場合は、最終調製物にタンパク質が混入していることが示唆されます。

230 nm（A₂₃₀）の吸光度は、カオトロピック塩などの化学汚染物質の存在の確認に使用できます。PCRなどの酵素プロセスにおける化学的干渉を最小限に抑えるには、A₂₆₀/A₂₃₀比が2.0超であることが理想的です。高純度のサンプルが必要な場合、この比率を評価することが重要です。

血液サンプルを用いて、GenElute™-E single-spin DNA/RNA精製システムの、吸収スペクトル、A₂₆₀/₂₈₀比、およびA₂₆₀/₂₃₀比を評価しました。結果を、競合製品を使用した同じサンプルのシリカスピンプレップ精製で得られた結果と比較しました（図3および表1）。データから、GenElute™-E精製システムでは、シリカ結合-洗浄-溶出調製法と比較して、より高いゲノムDNA純度が得られ、最終サンプル調製物の生物学的・化学的汚染物質が少ないことが示唆されました。

図3. A）供給業者XのシリカベースDNA精製スピンプレップキットまたはB）GenElute™-E single-spinネガティブクロマトグラフィーDNA精製キットを用いて血液から調製したゲノムDNAのUV吸収スペクトル。挿入したグラフは、溶出分画の10X濃度での測定です。不純物はシリカ溶出画分でのみ検出されています。黒い線は、何らかのプロセス汚染物質の影響がみられた、示された方法を使用して精製されたサンプルのスペクトルを示しています。赤い線は、ベースライン対照として使用した、プロセス汚染物質を含まない精製サンプルのスペクトルです。オレンジ色の線は、実際のサンプルを使用していない精製方法のスペクトルであり、分光光度測定値に対するプロセス汚染物質の影響を示しています。

表1. シリカおよびネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）精製法を用いて精製したDNAについて算出したA260/280およびA260/230比。データから、GenElute™-E single-spin精製キットを用いたネガティブ クロマトグラフィーでは良好な純度が得られ、最終サンプル調製物の生物学的・化学的汚染物質が少ないことが示唆されました。

試料の種類	精製方法	A260/280 （最適範囲1.8～2.0）	A260/230 （最適範囲2.0～2.2）
ヒト血液	シリカベーススピンプレップキット（供給業者X）	2.45	0.57
	GenElute™-Eネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）	1.83	2.20

ゲル電気泳動により評価した断片化DNAおよび低分子量核酸不純物

ゲル電気泳動によるサイズ分離により、サンプルの純度を視覚的かつ定量的に評価できます。大きなゲノムDNAは小さいDNA/RNA断片よりもゆっくりと移動します。その結果得られたバンドは、蛍光色素を用いて観察または定量できます。

シリカベーススピンプレップキット（供給業者X）またはサイズ排除によるネガティブクロマトグラフィー（GenElute™-E single-spin DNA精製キット）を用いてマウス肝臓組織から調製した精製DNAサンプルを、アガロースゲルで分離しました。核酸染色剤として、SYBRグリーンを使用しました。結果を正規化するために、各精製サンプルから同じ質量のDNAをゲルの各レーンにロードしました。トランスイルミネーターでアガロースゲルを可視化すると、シリカベースの精製法と比較して、ネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）法では、ゲノムDNAの濃い単一バンドが得られることが示されました（図4）。

シリカメンブレンスピンカラムから溶出したサンプルでは、ゲルの下端にぼんやりした複数のバンドが認められました。これは、最終調製物中に低分子RNAまたは断片化されたDNA分子が混入したことを示しています。ゲルのローディングはサンプル中のDNA（260 nmの吸光度によって決定）に対して正規化したため、これらのデータは、この方法ではゲノムDNA収量が過大評価されることを示唆しています。混入している小さい核酸分子も吸光度測定に寄与するためです。GenElute™-Eネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）法を用いて得られた強度の高い単一のDNAバンドは、これらの組織サンプルから得たゲノムDNAの純度が高いことを示唆しています。結果は蛍光分析法により定量化しました（図5）。

図4. マウス肝臓組織サンプルから精製したゲノムDNAのゲル電気泳動。シリカベーススピンプレップ法（供給業者X）またはサイズ排除によるネガティブクロマトグラフィー（GenElute™-E single-spin DNA精製キット）を用いてマウス組織を精製しました。同量のDNAがアガロースゲルの各レーンにロードされるようにサンプルを調整しました。結果は、シリカベースの方法を使用して精製したサンプル中に、混入したRNAまたは断片化されたDNAが存在することを示唆しています。

図5 マウス肝臓組織サンプル由来のゲノムDNA（gDNA）の算出収量と、混入したRNAまたは断片化されたDNAの量。シリカベーススピンプレップ法（供給業者X）またはサイズ排除によるネガティブクロマトグラフィー（GenElute™-E single-spin DNA精製キット）を用いてサンプルを精製しました。DNA量は、SYBRグリーン染色の蛍光シグナルを定量することで算出しました。結果は、シリカベースの精製スピンカラムを使用して調製したサンプル中に、少量ですが重要な量のRNAまたはDNAの混入物が存在することを示唆しています。

qPCRにおける干渉

シリカベースの精製法では、精製中のサンプルに変性塩やエタノールなどの有機溶媒が導入されます。これらの混入物は下流のアプリケーションに容易に移行し、酵素反応を阻害する可能性があります。このような混入物を除去すると、qPCRなどの酵素を使用する実験手法の感度と堅牢性が高まります。

酵素プロセスを阻害する混入物の存在を評価するために、それぞれのスピン精製方法を用いて、マウス腎臓サンプルからゲノムDNAを精製しました。最終サンプルをqPCR分析実験に使用しました（図6）。ベータアクチンに対応する遺伝子も内因性対照として増幅しました。データから、シリカ精製サンプルの増幅曲線が、GenElute™-Eネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）精製法を使用して調製したサンプルに比べて、右にシフトしていることが示されました。これは、干渉する混入物が存在するか、シリカ精製サンプルの収量が計算値よりも低いことを示唆しています。

図6. ゲノムDNA調製物中の干渉混入物を定量するためのqPCR分析A）供給業者Xのシリカベーススピンプレップキット（青色曲線）およびGenElute™-Eネガティブクロマトグラフィー（サイズ排除）スピンプレップキット（オレンジ色曲線）を用いてマウス腎臓組織から調製したゲノムDNAの増幅曲線。シリカ精製サンプルの曲線はGenElute™-E精製サンプルと比較して右にシフトしており、干渉混入物の存在またはシリカ調製物の開始濃度の過大評価を示唆しています。B）β-アクチン遺伝子を内因性対照参照として使用したCqの計算値。

結論

GenElute™-E single-spin DNA/RNA精製キットでは、サイズ排除に基づいて核酸精製を行う便利なネガティブクロマトグラフィー法が行えます。これらのキットは、従来のシリカベーススピンプレップの代替法であり、UV分光測定、ゲル電気泳動、およびqPCRで実証されているとおり、純度が改善されています。