SDS-PAGE 소개 - 크기 기준 단백질 분리

폴리아크릴아미드 겔은 고도로 가교 결합된 겔 기질이 생기는 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드(N,N’-methylenebisacrylamide)의 반응에 의해 생성됩니다. 이 겔은 단백질이 전기장에 반응해 통과하는 체 역할을 합니다. 단백질에는 전체 양전하 또는 음전하가 포함되어 있습니다. 이를 통해 단백질 분자는 분자에 순전하가 없는 등전점을 향해 움직일 수 있습니다. 단백질을 변성시키고 균일한 음전하를 주면 단백질이 양의 전극을 향해 움직일 때 크기를 기준으로 단백질을 분리할 수 있습니다.

그림 1. 단백질 시료의 SDS-PAGE 및 컬러 버스트 단백질 표지자(C1992)

프로토콜

필요한 재료 및 시약

• 전원 공급 장치, 유리판, 스페이서 및 콤이 포함된 수직 전기 영동 장치

필요한 시약	시약 성분	제품 번호
아크릴아미드/비스 아크릴아미드 용액	아크릴아미드 29.2 g 비스 아크릴아미드 0.8 g	01696 M7279
겔 캐스팅 버퍼	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8(분해 겔 준비용): 80 mL의 증류수에 18.15 g의 트리스 염기를 녹입니다. 6N HCI를 사용하여 pH를 8.8로 조정합니다. 증류수로 100 mL의 최종 용량을 만듭니다. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8(축적 겔 준비용): 80 mL의 증류수에 6 g의 트리스 염기를 녹입니다. 6N HCI를 사용하여 pH를 6.8로 조정합니다. 증류수로 100 mL의 최종 용량을 만듭니다.	93362
2X Laemmli 로딩 버퍼	브로모페놀 블루 0.004% 2-메르캅토에탄올 10% 글리세롤 20% SDS 4% Tris-HCl 0.125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10X 러닝 버퍼	Tris-HCl 25 mM 글리신 200 mM SDS 0.1%(w/v)	93362 G8898 L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% 과황산 암모늄	과황산 암모늄	A3678
TEMED	TEMED	T9281

참고: 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드는 신경독입니다. 모든 단계는 무분말 장갑을 착용하고 실시하십시오.

겔 준비

• 겔 캐스팅 장치의 유리판과 스페이서를 탈염수와 에탄올로 세척합니다.
• 안정적이고 고른 표면에서 유리판과 스페이서를 조립합니다.
• 필요한 겔의 비율에 따라 다음 용량(10 mL용)을 사용하여 분해 겔 용액을 준비합니다.

겔 %	물(mL)	30 % 아크릴아미드(mL)	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8(mL)	10 % SDS(µL)	10 % APS(µL)	TEMED*(µL)
8%	4.6	2.6	2.6	100	100	10
10%	3.8	3.4	2.6	100	100	10
12%	3.2	4.0	2.6	100	100	10
15%	2.2	5.0	2.6	100	100	10
*TEMED가 마지막에 첨가하는 성분이어야 합니다

• 스페이서와 함께 조립된 판에 겔 용액을 붓습니다. 고르고 수평적인 분해 겔 표면을 유지하려면 물 또는 이소프로판올(I9516)로 표면을 덮습니다.
  
• 상온에서 약 20-30분 동안 겔을 굳힙니다.
  
• 다음 용량(10 mL용)을 사용하여 축적 겔 용액을 준비합니다.
  

겔 %	물(mL)	30 % 아크릴아미드(mL)	0.5 M Tris-HCl, pH 6.8(mL)	10 % SDS(µL)	10 % APS(µL)	TEMED*(µL)
5%	5.86	1.34	2.6	100	100	10

*TEMED는 마지막에 첨가해야 합니다

• 분해 겔 위에 덮인 물 또는 이소프로판올을 버립니다.
• 5 %의 축적 겔 용액을 넘칠 때까지 첨가합니다. 겔 또는 웰 근처에 기포가 갇히지 않도록 즉시 콤을 삽입합니다.
• 상온에서 약 20-30분 동안 겔을 굳힙니다.
  

시료 조제

• 단백질 시료(세포 또는 조직 용해물) 용량까지 동일한 용량의 로딩 버퍼를 첨가합니다.
  
• 위의 혼합물을 95 °C에서 5분 동안 끓입니다. 16000 xg에서 5분 동안 원심분리합니다.
  
• 이 시료는 -20 °C에 보관하거나 겔 전기 영동을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

겔 염색

Coomassie Blue 염색: Coomassie Brilliant Blue R-250을 사용한 단백질 겔 염색은 SDS-PAGE에 의해 분해된 단백질을 시각화하는 일반적 절차입니다. 감도가 높으며 겔의 장기 보관에 적합합니다.

필요한 시약

• 겔 고정 용액(500 mL)
  
       메탄올(M3641) 250 mL
       빙초산(695092) 50 mL
       물 200 mL
  
  
• Coomassie 용액
  
       CBB R-250(B6529) 0.1%
       메탄올(M3641) 40%
       빙초산(695092) 10%
       Whatmann 1번 여과지를 사용하여 염색 용액을 여과합니다.
  
  
• 탈염 용액
  
       메탄올(M3641) 50 mL
       빙초산(695092번) 35 mL
  
  
• 겔 보관 용액
  
       빙초산(695092) 25 mL
       물 475 mL

절차

• 전기 영동 후 겔 고정 용액이 들어 있는 플라스틱 트레이에 겔을 놓습니다. 트레이를 교반 테이블 위에 놓고 2시간 동안 단백질을 고정합니다.
  
• 겔 고정 용액을 제거하고 Coomassie 용액을 첨가합니다.  교반 테이블 위에 놓고 겔을 2-4시간 동안 염색합니다.
  
• 염색 단계 후 증류수로 몇 차례 겔을 세척하여 남은 염료를 제거합니다.
  
• 겔에 탈염 용액을 첨가합니다. 교반 테이블 위에 놓고 약 4시간 동안 깨끗한 배경에 깨끗한 파란색 띠가 보일 때까지 탈염합니다.
  
• 탈염 후 겔을 겔 보관 용액에 보관하고 필요에 따라 촬영할 수 있습니다.

실버 염색

머크는 SDS-PAGE 겔에 적합한 고감도 단백질 검출 실버 염색 키트를 제공합니다. 다음 시약이 추가로 필요합니다.

• 고정 용액
  
       에탄올(E7023) 50 mL
       아세트산 10 mL
       물 40 mL
  
  
• 30% 에탄올(E7023) 용액

절차

• 전기 영동 실행 후 겔을 고정 용액에 40분 동안 담급니다. 고정제에 밤새 담가 두면 더 깨끗한 배경이 만들어집니다.
  
• 고정액을 제거하고 30% 에탄올 용액으로 10분 동안 겔을 세척한 다음 초순수로 10분 동안 세척합니다.
  
• 물을 가만히 따라내고 감광액에서 10분 동안 겔을 배양합니다.
  
• 감광액을 제거하고 겔을 각각 10분 동안 물로 2회 계속하여 세척합니다.
  
• 물을 가만히 따라내고 겔을 실버 용액에 10분 동안 담급니다.
  
• 실버 용액을 가만히 따라내고 물에서 겔을 1분 30초 동안 세척합니다.
  
• 물을 버리고 겔을 현상액에 3-7분 동안 담급니다.
  
• 현상액에 5 mL의 정지액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 현상액/정지액을 제거하고 초순수에서 15분 동안 겔을 세척합니다.
  
• 겔 사진을 찍을 수 있고 신선한 초순수에 보관할 수도 있습니다.

이중 염색의 경우 CBB R-250을 사용하여 겔을 염색한 후 위의 절차를 따라 실버 염색합니다.

형광 염료: 머크는 단백질 전기 영동용 형광 SYPRO 및 Lucy 염료를 제공합니다. 겔을 어두운 곳에서 형광 염료에 담그거나 전기 영동 도중 음극 버퍼와 혼합할 수 있습니다.

염색 프로토콜은 사용되는 염료에 따라 달라지며 아래 문서에서 찾을 수 있습니다.

• SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain(PDF)
  
• LUCY^® 506 Solution(PDF)
  

가역적 겔 염색

가역적 겔 염색을 사용하면 SDS-PAGE 이후 단백질 웨스턴 블로팅(western blotting)을 진행할 수 있습니다.

R-PROB 염색: R-PROB는 PAGE 겔과 웨스턴 블롯에서 단백질을 검출하는 독특한 염료입니다.

필요한 시약:

• 멤브레인/폴리아크릴아미드 겔용 가역적 단백질 검출 키트(RPROB)
  
• 고정액(F7264)
  
• 10 % 아세트산
  
• EDTA 50 mM

절차

• 전기 영동 후 겔을 고정액에 20분 동안 담급니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
  
• 겔을 각각 30분씩 계속하여 2회 물에 헹굽니다.
  
• 완만한 교반으로 20-40분 동안 염색 용액에서 겔을 배양합니다.
  
• 10 % 아세트산에서 남는 염료를 씻어냅니다.
  
• 탈염하려면 겔을 EDTA로 세척한 후 각각 15분 동안 물 또는 고정액에서 2회 세척합니다.

구리 염색: 단백질 이동과 분리를 확인하기 위해 CuCl₂와 같은 가역적 염료로 겔을 염색할 수 있습니다.

필요한 시약

• 0.3 M CuCl₂ 용액
  
• 0.25 M Tris 및 0.25 M EDTA 용액

절차

• 전기 영동 후 겔을 증류수에서 최대 30분 동안 헹굽니다.
  
• 0.3 M CuCl₂ 용액에 10분 동안 겔을 담급니다.
  
• 탈염수로 헹굽니다.
  
• 파란색 배경에서 깨끗한 구역으로 단백질을 시각화할 수 있습니다.
  
• 웨스턴 블롯을 위해 겔을 완전히 탈염하려면 염색된 겔을 0.25 M Tris와 0.25 M EDTA 용액(pH 9)에서 반복적으로 세척합니다.
  
• 전이 단계를 진행하기 전에 탈염된 겔을 전이 버퍼로 옮깁니다.

그림 2. 블로팅 및 수직 전기 영동 시스템

전기 영동 후 단백질을 멤브레인으로 전이하려면 여기서 프로토콜을 찾으십시오.

참조문헌

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.