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mRNA 백신 및 치료제 제조 전략

코로나19 백신의 빠른 개발과 성공은 mRNA의 위력을 증명했지만, 그 잠재력은 이러한 응용분야를 훨씬 뛰어넘습니다. mRNA 기술은 충족되지 않은 의학적 요구를 해결하고 암, 심장병 또는 전염성 질병의 새로운 치료 옵션을 제공할 수 있는 흥미로운 가능성을 가지고 있습니다.

mRNA를 환자 세포의 시토졸에 전달하면 치료 또는 예방 기능을 할 수 있는 표적 단백질의 생성을 유도할 수 있고, 백신 접종의 목적인 면역 반응을 유발하는 항원으로 작용할 수 있으며, 결함이 있는 단백질을 대체하거나 항암 반응을 활성화할 수 있습니다.

백신 및 유전자 치료에 널리 사용되는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 전달 시스템과 달리, mRNA 기술과 같은 비바이러스 전달 시스템은 더 나은 안전성 프로필, 높은 수준의 다목적성, 템플릿화된 공정을 사용한 간소화된 제조 등 다양한 이점을 제공합니다. 개발 연구원들은 프로세스 및 전달 플랫폼을 최적화하여 mRNA의 안정성, 번역 및 안전성을 향상하는 데 전념하고 있습니다.

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mRNA 제조에 대한 고려사항

mRNA 백신 및 치료제의 개발과 제조는 비교적 간단하고 확장 가능하며 매우 빠릅니다(그림 1). 개발에서 임상 및 승인까지의 기간 단축으로 mRNA 기술은 전염성 질병 발병에 대한 신속하고 효과적인 대응 뿐만 아니라 치료에 대한 수요가 높은 질병을 해결하는 새로운 치료적 접근법 개발에도 활용할 수 있습니다.

mRNA는 효소 공정을 통해 체외 합성에 의해 생성됩니다. 기존의 체내 단백질 발현과 달리, 시간이 많이 걸리는 복제 및 증폭 단계가 필요하지 않으며 세포 및 숙주 세포 단백질을 제거할 필요가 없습니다. 이 간소화된 제조 공정은 놀라운 속도와 유연성을 발휘하는데, 이는 모든 대상에 동일한 반응 물질과 용기를 사용하기 때문이며 GMP 설비에서 공정 및 제제에 대한 최소한의 적응으로 매우 짧은 시간 내에 새로운 단백질 표적으로 전환할 수 있도록 합니다.

그림 1.mRNA 제조를 위한 일반 공정의 개요.

최종 제품의 공정, 생산량, 품질, 안전성을 최적화하기 위해 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 여기에는 예를 들면, 올바른 공정 화학 물질과 원재료의 선택이 포함됩니다. 특히 체외 전사 및 다운스트림 정제 과정에서 mRNA는 보호되지 않은 상태라 효소 분해의 위험이 높습니다. 엔도뉴클레아제 활성 부재 검사를 거친 제품을 사용하면 mRNA의 제조부터 정제, 제제까지 전반적인 공정에서 RNase에 의한 분해 위험을 최소화할 수 있습니다. 미생물 및 내독소 오염의 위험을 통제하려면 미생물 및 내독소 수치가 낮게 지정된 제품을 사용하는 것도 중요합니다. 이는 특히 주사제와 같은 고위험 응용분야의 경우, 오염된 미생물이 해를 끼칠 가능성이 높기 때문에 더욱 중요합니다.

이 웹페이지는 mRNA 전용으로, 기술 및 제품 선택에 대한 심층적인 정보를 제공하여 제조부터 최종 충전까지 확신을 가지고 mRNA 공정을 탐색할 수 있도록 도와줍니다. 정보에 입각한 결정을 돕기 위해 당사의 "모든 mRNA 플랫폼을 위한 역량 및 솔루션 활성화" 및 "mRNA 약물 제조를 위한 공정 화학 물질" 안내책자에서 제품, 서비스 및 전문 지식에 대한 자세한 정보를 제공하고 있습니다.

mRNA: 구조 요소와 그 기능

mRNA 구성은 관심 유전자의 효율적인 발현을 보장하도록 디자인되었습니다. 안정성, 유전자 발현 및 효율적인 단백질 번역은 몇 가지 구조 요소에 따라 달라집니다(그림 2).

그림 2.mRNA 구조.

염기서열의 5' 말단에 있는 캡 영역: mRNA 성숙, 효율적인 단백질 번역을 위한 리보솜의 인식, 안정성 향상을 위한 핵산분해효소 소화로부터 보호에 필수적입니다.
mRNA 코딩 영역의 업스트림 및 다운스트림 도메인에 있는 미번역 영역(UTR): mRNA의 번역, 국소화, 안정성 조절은 단백질 발현 효율을 개선하는 데 활용할 수 있습니다.
리딩 프레임 또는 코딩 시퀀스 영역을 엽니다. 관심 유전자(GOI)를 포함합니다.
폴리(A) 테일: 3' 엑소뉴클레아제에 의한 소화를 방지함으로써 단백질 번역 및 mRNA 안정성에 필수적입니다.

mRNA 제조

그림 1에서 볼 수 있듯이, mRNA 기반 치료제 및 백신의 생산은 플라스미드 DNA(pDNA) 템플릿으로 시작하여 선형화되고 RNA로 전사됩니다.

pDNA 생산: pDNA 템플릿에는 DNA 의존 RNA 중합 효소 촉진자와 mRNA 구성에 해당하는 서열이 포함되어 있습니다. pDNA 구성의 주요한 역할을 고려할 때 그 디자인과 순도는 mRNA 제품 최적화에 중요한 요소가 됩니다. 필요한 pDNA는 박테리아 세포, 일반적으로는 대장균 내에서 증폭되고 후속 정제 단계는 순수하고 농축된 원형 pDNA를 생성합니다. 핵산의 큰 크기와 높은 점도, 전단 민감도, pDNA와 불순물 간의 유사성과 관련된 문제를 극복하기 위한 전략은 당사 간행물인 "플라스미드 DNA 다운스트림 정제 프로세스 디자인"에서 자세히 다루고 있습니다.

pDNA 선형화: 원형 pDNA는 반응 버퍼¹에서 제한 효소를 사용하여 선형화되어, 원하는 mRNA를 전사하는 RNA 중합 효소를 위한 템플릿 역할을 합니다. 제거해야 할 추가 불순물로 이어지는 원하지 않은 형태의 mRNA를 생성할 수 잇는 전사 판독 사례를 피하기 위해 선형화가 필요합니다.

pDNA 정제: 제한 효소, 소혈청알부민(BSA), DNA 절편, 내독소 및 기타 물질과 같은 불순물이 제거됩니다. 대부분의 실험실 규모 공정은 용매 추출 기술을 사용하는데, 이는 GMP 생산 환경에는 적합하지 않습니다. 대안으로 접선유동여과(TFF)와 크로마토그래피는 이러한 정제 단계를 위한 효율적인 불순물 제거 기술입니다. 후속 공정 단계 및 궁극적으로는 환자 안전에 큰 영향을 미치는 내독소는 pDNA 제조 공정의 주요한 불순물로 확인되었습니다. 세제는 내독소 제거에 이용될 수 있으며, 예를 들어 지속 가능하고 생분해 가능하며 REACH를 준수하는 적절한 대안으로서 Deviron^® C16 세제를 사용할 수 있습니다.²

당사의 전용 기술 문서에서 pDNA 생산 및 정제에 대해 자세히 알아보세요.

체외 전사(IVT): DNA 주형 역할을 하는 선형화된 pDNA는 자연 전사 과정의 요소를 사용하여 효소 반응에서 mRNA로 전사됩니다. 체외 전사의 핵심 구성 요소에는 DNA 염기서열을 RNA 염기서열로 전사하는 RNA 중합 효소, mRNA의 구성 단위인 삼인산 뉴클레오사이드(NTP), mRNA 생산량을 개선하는 무기 파이로인산분해효소(IPP), RNA 분해를 방지하는 RNase 억제제 등이 있습니다. 전사 버퍼에는 일반적으로 디티오트레이톨(DTT, 이황화 결합 환원제로 RNase 활성을 억제하여 mRNA 안정성을 지원하는 성분)과 스페르미딘(전사 효율과 핵산 안정성을 개선하는 성분)과 같은 화학 물질이 포함됩니다.
라만은 강력한 분석 도구로서 잠재적으로 IVT 단계와 같은 효소 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 지금까지는 IVT 단계를 모니터링하기 위해 지루한 오프라인 분석을 수행하였으며, 반응 조건 및/또는 생산성 목표가 충족되지 않을 경우 즉각적인 조치를 취할 수 없었습니다. 이 문제는 라만 분광법으로 해결할 수 있는데, 라만 분광법은 CPP 및 CQA를 훨씬 빠르게 측정할 수 있어 작업자가 최적의 공정 조건을 보장하기 위한 결정을 더 빨리 내릴 수 있습니다.

캡핑: 전사 이후, 최종 mRNA 구조는 세포에서의 안정성과 효율적인 형질 도입을 위해 5’ 캡 구조를 필요로 합니다. 캡은 두 가지 방법으로 추가할 수 있는데, 두 단계의 효소 공정을 통해 전사와 공동으로 또는 전사 후 추가할 수 있습니다.
공동 전사 캡핑은 전사 혼합물에 캡 유사체와 구아노신 삼인산(GTP)을 추가하여 수행하며, 일반적으로 하나의 GTP에 대해 4개의 캡 유사체의 비율로 추가합니다. 공동 전사 캡핑은 동일한 반응기 혼합물에서 IVT 단계 동안 수행되기 때문에 효소적 캡핑보다 저렴하고 빠릅니다. 그러나 효율성과 생산량이 낮고 잘못된 결합 또는 역편입으로 인해 비캡핑 불순물이 생성될 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 역전방지 캡 유사체(anti-reverse cap analog, ARCA)가 개발되어 5’ 캡의 역편입을 방지하여 번역 효율성을 높였습니다.
효소적 캡핑(또는 번역 후 캡핑)은 체외 전사 혼합물에서 mRNA를 정제한 후 수행합니다. 이 반응은 mRNA 구조에 캡핑 구조를 추가하기 위해 일반적으로 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 사용합니다. 효소적 캡핑은 캡핑 효율이 매우 높지만 비용이 더 많이 소요되고 추가 단위 작업이 필요합니다.

이러한 공정 단계를 거친 다음에는 최종 의약품을 생산하기 위해 mRNA를 정제하고 제제합니다.

mRNA 정제

체외 전사 단계 이후 불순물을 비롯하여 내독소, 면역원성 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 DNA 템플릿, RNA 중합 효소, 원소 불순물 등 이전 단계에서 사용된 물질로부터 mRNA를 정제합니다. 이 단계에서 mRNA는 TFF, 효소적 캡핑 및/또는 크로마토그래피 단계를 위해 적절한 버퍼 내에 있어야 합니다. mRNA 정제 및 잔류 DNA 제거를 위한 몇 가지 옵션을 사용할 수 있습니다.

접선유동여과(TFF)는 멤브레인에 걸러지지 않는 더 작은 불순물로부터 mRNA를 효율적으로 분리하는 데 사용됩니다. 일반적으로 DNA 템플릿은 DNase 첨가에 의해 분해되며, 그 결과 생성된 작은 DNA 절편은 TFF를 사용하여 더 큰 mRNA 분자에서 쉽게 분리할 수 있습니다. mRNA의 크기에 따라 30~300 kDa 범위의 분자량 컷오프가 사용될 수 있습니다. TFF를 사용하면 동일한 단위 생산 내에서 제품을 정제, 농축, 정용여과할 수 있습니다. 그러나 작은 DNA 절편은 mRNA에 혼성화되어 추가적인 불순물을 생성할 수 있으며, 캡처를 사용하여 DNA 템플릿을 제거하면 이를 피할 수 있습니다.³

역상 이온 쌍(IPRP), 음이온 교환(AEX), 폴리(dT) 캡처를 이용한 친화성 크로마토그래피(AC)(그림 3) 등의 크로마토그래피 기술은 DNA 템플릿을 효율적으로 제거하여 DNA 템플릿 분해의 필요성과 한외여과/정용여과 단계에서 발생할 수 있는 혼성화 위험을 제거합니다.¹ 원치 않는 생성물과 올리고뉴클레오타이드 불순물을 제거하기 위해 효소적 캡핑 단계 이후에 크로마토그래피도 사용됩니다. 그러나 비용이 더 많이 들고 여재 교환 및 후속 단계를 준비하려면 여전히 TFF 단계가 필요합니다.

역상 이온 쌍, 음이온 교환 및 mRNA 정제를 위한 친화성 크로마토그래피의 비교(DBC: 동적 결합력).<sup>4,5</sup>

그림 3:역상 이온 쌍, 음이온 교환 및 mRNA 정제를 위한 친화성 크로마토그래피의 비교(DBC: 동적 결합력).^4,5

역상 이온 쌍(IPRP)은 일반적으로 소규모로 사용되며 매우 효율적이고 신속하게 RNA를 정제하고 DNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 짧은 전사물로부터 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 효과적으로 분리합니다. 이 방법의 단점으로는 GMP 제조 적합성에 영향을 미치는 용매 사용, 복잡한 제거를 위해 정용여과 단계가 필요한 이온 쌍 시약에 의한 mRNA의 복합체화 및 이 기술을 캡처보다는 폴리싱에 더 적합하게 만드는 단백질 및 응집체 찌꺼기에 대한 민감성 등이 있습니다.

음이온 교환 크로마토그래피(AEX)는 10 mg RNA/mL를 초과하는 높은 동적 결합력을 가지고 있으며 dsRNA, 언캡핑 RNA, RNA-DNA 하이브리드 및 헤어핀 mRNA 같은 기타 RNA 구조 등 면역원성 불순물을 제거하는 데 매우 효율적입니다. AEX 과정을 통해 수용액을 사용할 수 있기는 하지만, 레진에 결합된 큰 mRNA 분자를 탈착하기 위해서는 잠재적 독성이 있는 카오트로픽 제제를 추가하고 최대 85°C의 온도에서 작동해야 될 수 있습니다. 상온에서의 용리는 일반적으로 500염기 미만의 mRNA 종에 적용됩니다.⁵

친화성 크로마토그래피(AC) 폴리(dT) 캡처는 전장 mRNA 전사물의 폴리(A) 테일을 특히 포획하기 위해 레진을 사용합니다. 이 공정은 DNA, 뉴클레오타이드, 효소, 버퍼 성분 및 폴리(A) 테일이 없는 기타 불순물을 효율적으로 제거합니다. AEX와 마찬가지로 수용액을 사용할 수 있으며, AC의 경우 일반적으로 염 구배를 사용합니다. IPRP 및 AEX와 달리 AC는 dsRNA를 ssRNA에서 식별할 수 없으며, mRNA에 혼성화된 DNA 절편과 같은 기타 생성물 관련 불순물을 제거하는 데 효율적이지 않습니다. 이러한 이유로 일반적인 접근 방식은 AC를 최초 크로마토그래피 단계로 적용한 다음 AEX를 폴리싱 목적으로 적용하는 것입니다.

최종 농축 및 정용여과는 크로마토그래피 단계에 이어서 수행하여 제품 순도를 극대화하고 제제 또는 보관을 위해 mRNA를 적절한 버퍼로 옮깁니다. 이 단계에서는 동일한 단위 생산 내에서 mRNA를 추가로 정제, 농축, 정용여과할 수 있습니다. 이 TFF 단계에 이어 멸균 여과 단계를 수행할 수 있지만, 분자량이 5000 kDa 이상인 mRNA의 멸균 등급 여과는 어려울 수 있습니다.

mRNA 제제

최종 mRNA 정제 단계 이후, 그 다음 고려사항은 전달 메커니즘입니다(그림 4). 전달 도구는 mRNA 백신 및 치료제의 효과를 보장하는 데 매우 중요합니다. 가장 진보된 전달 방식 중 하나는 지질과 폴리머의 조합에 기반하며, 리포플렉스를 형성하는 지질에 결합된 올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 폴리플렉스를 형성하는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양전하를 띠는 폴리머가 포함됩니다. 지질 나노입자(LNP)는 가장 일반적으로 사용되는 mRNA 전달 플랫폼입니다.

그림 4.여러 mRNA 전달 시스템을 이용할 수 있습니다.

지질 선택 시 고려사항

지질을 선택할 때는 효과를 극대화하고 최적의 생체 분포를 보장하기 위해 전달 경로를 고려하는 것이 필수적입니다. 지질 선택과 함께 개별 지질 간의 비율은 이중층 유동성 및 LNP 융합성에 직접적인 영향을 미치는 미세 조정에 매우 중요합니다. 지질 선택 시에는 유형, 공급원, 품질을 포함하여 여러 가지 중요한 요소가 작용하는데, 이는 최종 제제의 입자 특성, 안정성 및 방출 프로필과 같은 불순물 프로필과 특성에 직접적인 영향을 미칩니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 일관된 지질 품질이 필요하며, 이는 지질 합성에 사용되는 원료의 품질과 지질의 재료 특성에 크게 좌우됩니다. 일관되고 높은 제품 품질을 갖춘 합성 지질과 신뢰할 수 있는 파트너가 제공하는 맞춤형 지원 및 서비스는 개별 요구 사항을 충족하고 최적의 최종 제품 성능을 보장하는 데 이상적입니다.

각 LNP는 mRNA를 운반하고 분해로부터 보호할 수 있는 각기 다른 네 가지 지질로 구성됩니다.

양이온성/이온화 지질은 정전기 상호작용을 통해 RNA를 캡슐화하는 데 필요합니다. 간세포로의 전달(단백질 발현을 촉진하거나 억제하기 위함)에는 이온화 지질(수동적 표적화, 엔도솜 방출)이 필요한 반면, 면역 세포에 의한 흡수는 훨씬 더 쉽습니다. 강한 양이온성 지질은 이러한 목적을 달성할 뿐 아니라 세포질로 RNA를 효율적으로 방출하는 역할을 합니다. 양이온성 지질의 구조는 LNP 활성, 독성 및 생체 분포에 큰 영향을 미칩니다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질은 콜로이드의 안정성을 제공하고 단백질이 입자에 결합되지 않게 함으로써 단백질을 면역 체계로부터 보호하고 순환이 더 길어지게 합니다. PEG 사슬과 지방산 사슬의 길이는 순환의 수명과 융합성 또는 입자가 LNP의 엔도솜 멤브레인과 얼마나 잘 융합할 수 있는지 결정합니다. 순환을 연장하기 위해서 폴리에틸렌 글리콜디스테아릴글리세롤(DSG PEG 2000)과 같은 더 긴 지방산 사슬을 활용할 수 있습니다. PEG 농도도 입자 크기에 영향을 미칩니다. 그러나 PEG를 사용하면 항체가 형성되어 예방접종 효과가 떨어질 수 있습니다.

중성/음이온성 지질은 구조적 안정성을 제공하고 융합성 및 생체분포를 정의하는 역할을 합니다. 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3- 포스포에탄올아민. 예를 들어, 엔도솜 방출에 중요한 역할을 하는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 함유한 LNP는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포코올린(DSPC)에 비해 mRNA의 간 전달을 향상시키는 것으로 나타났습니다.⁵ 연구 결과 이러한 보조 지질은 RNA의 안정적인 캡슐화를 돕는 것으로도 나타났습니다.⁶

콜레스테롤은 LNP의 이중층 밀도, 유동성 및 흡수(뗏목 형성)를 조절하는 데 사용됩니다. 동물 유래 버전과 합성 버전의 콜레스테롤을 시중에서 구할 수 있지만, 합성 콜레스테롤은 고순도, 프리온과 같은 동물 유래 분자의 부재, 확장성 및 일관성 높은 품질을 포함한 여러 장점을 제공합니다.

정제된 mRNA는 여러 기술을 활용해 전달 입자로 제형화할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 용매 주입 기술에서는 지질을 에탄올과 같은 용매에 용해하고 직교류 혼합 또는 미세 유체 혼합을 사용하여 mRNA를 함유하는 pH가 낮은 수성 버퍼에서 빠르게 혼합해 LNP를 생성합니다. pH가 낮은 버퍼를 중성 버퍼로 정용여과한 후 한외여과를 사용하여 입자를 농축합니다. 지질은 낮은 pH에서 가수분해되어 지질 이중층 구조, 제형의 안정성 및 약물 방출 특성에 영향을 미칠 수 있는 가수지질과 같은 불순물이 형성될 수 있으므로 TFF 단계는 신속하게 진행해야 합니다. 지질의 분해는 입자의 크기를 증가시켜 응집을 일으킬 수 있습니다.

LNP는 다른 전달 시스템에 비해 안정성과 구조적 가소성 및 향상된 유전자 전달이 매우 우수합니다. 네이키드 mRNA에 비해 트랜스펙션 속도를 증가시켜 혈류에 존재하는 RNase에 의한 분해 위험 없이 정맥주사를 가능하게 하고 특정 리간드가 통합된 경우 활성 표적화를 가능하게 합니다. LNP의 단점은 콜드체인 물류체계가 필요할 수 있다는 사실입니다. 또한 LNP를 사용한 멸균 여과가 항상 가능한 것은 아니며, 이러한 경우 감마선 조사, 가열 멸균, 고압 멸균 또는 격리 처리와 같은 대체 방안을 고려해야 합니다.

mRNA 제제에 대한 자세한 내용은 당사의 백서 "지질 나노입자 제제를 임상 및 상업적 제조로 발전시키기 위한 고려사항"을 참조하세요.

확장 시 고려사항

mRNA 제조 공정 확장 시 염두에 두어야 할 고려사항이 여러 가지 있으며, 소규모 작업을 진행할 때는 공정 개발 중에 이러한 사항들을 최우선으로 고려해야 합니다.

mRNA 정제를 위한 용매 추출 및 침전 단계를 이용하는 방법은 확장이 어렵습니다. 게다가 유해 용매의 사용은 GMP 환경에 적합하지 않으며, TFF 또는 크로마토그래피로 대체할 수 있습니다.

mRNA는 RNase에 의해 몇 초 안에 분해될 수 있습니다. 따라서 해당 생성물과 접촉하는 모든 원료, 용액 및 장비에는 이 효소가 없어야 합니다.

적절한 전달 시스템은 백신 또는 치료제의 효율성에 기여하므로 신중하게 선택해야 합니다.

최종 제품이 큰 mRNA 복합체인 경우 제품의 멸균 여과에 대한 대안을 평가해야 합니다.

특별한 공급망 요건(예: 콜드체인)은 비용을 유발하는 요인입니다. 따라서 약물의 안정성을 신중하게 평가해야 합니다.

mRNA: 밝은 미래

mRNA 기술은 전례 없는 속도와 뛰어난 효율로 COVID-19 백신 후보물질의 개발을 가능하게 했습니다. 앞으로 이 기술은 질병 발생에 신속하게 대응할 수 있게 함으로써 백신 개발 분야에 혁신을 가져올 뿐만 아니라, 백신과 치료제 모두를 위한 신속하고 유연한 플랫폼이 되어 충족되지 못하고 있는 의료 수요를 해결하는 데 도움이 될 잠재력을 지니고 있습니다.

이러한 치료적 접근 방식이 최대한의 잠재력을 발휘할 수 있도록 하기 위해 혁신적인 솔루션, 전문지식 및 독창성을 모두 합쳐 생산 규모의 간단하고 강력한 플랫폼을 구축해야 합니다. 당사는 제품, 서비스 및 전문가 지원을 통해 의사 결정 과정을 간소화하여 성공적인 mRNA 완제의약품을 개발하는 길을 찾도록 돕고, mRNA 기반 백신 및 치료제 제조를 함께 발전시킬 수 있도록 최선을 다하고 있습니다.