微生物死滅曲線とは何か？
微生物死滅曲線は、哺乳類細胞に対し特定の抗生物質のばく露量を増やしていき、一定時間内にすべての細胞を死滅させられる最少濃度を決定する用量反応実験です。これは重要なステップであり、この後で抗生物質を使って形質未導入細胞を死滅させ、安定した細胞株を作ります。哺乳類細胞株は抗生物質に対する感受性がそれぞれ違うので、細胞株および抗生物質を変える場合は、常に微生物死滅曲線の実験を行うことをお勧めします。
微生物死滅曲線作成のための抗生物質の推奨濃度
下記表は、用量反応実験に採用できる汎用選択抗生物質の濃度範囲を示しています。
被験細胞株によって用量反応が変わる可能性があります。表中の濃度範囲は参考としてお使いください。死滅曲線実験は、選択抗生物質の初回使用時または新しい細胞株を使用するたびに行わなければなりません。
死滅曲線実験のプロトコル
以下では、細胞死滅曲線を作成する方法を段階的に説明します。
必要な材料：
- 健康状態にある細胞株
- 細胞株に対して推奨されている完全培地（培地+血清）
- 対象の抗生物質
ステップ：
- Trypsin処理または丁寧に掻き取ることで健康な接着細胞を集めます。
- 完全培地で細胞懸濁液を希釈し、96ウェルプレートの各ウェルに最終100 μLになるよう播種します。抗生物質処理日の推奨細胞密度は約50%です。
- 抗生物質処理前の24ウェルプレート中の通常細胞密度：
- 0.8～2.5 X 105細胞／接着細胞mL
- 2.5～4.5 X 105細胞／細胞懸濁液mL
- 37oCで一晩または全細胞が健康で良好状態になるまでインキュベートします。
注記：細胞が活発に分裂しているとき、抗生物質は最も効果を発揮します。このため用量反応がより正確になるよう、細胞密度の最適化をお勧めします。
図1．各ウェルの選択抗生物質濃度の例
- 培地を各濃度の選択抗生物質を含む新しい培地と交換します。96ウェルプレートの図（図1）に示したtriplicatesにおける各濃度を維持します。
- 抗生物質入り培地を48時間ごとに交換します。
- 定期的に光学顕微鏡で細胞を観察しながら、7～10日間培養します。使用した細胞株に応じて、培養期間を14日間まで延長できます。
- 10日目にMTTアッセイまたは高確度細胞カウンターで各ウェル中の細胞生死を判定します。
- 細胞増殖を完全に阻害する抗生物質の濃度を選びます。トランスフェクションの実験は、すべてこの濃度で行い、抗生物質添加後も増殖する抵抗性の形質導入細胞を安定した細胞株として選択します（図2）。
図2．微生物死滅曲線の一例
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