CAS9D10AP

CRISPR Cas9-D10Aニッカーゼプラスミド

• 別名: CAS9D10A プラスミド
• UNSPSCコード: 12352200
• NACRES: NA.51

特性

• リコンビナント: expressed in E. coli
• 品質水準: 200
• 包装: vial of 50 μL
• 濃度: 20 ng/μL in TE buffer; DNA (1μg of plasmid DNA)
• アプリケーション: CRISPR
• プロモーター: Promoter name: CMV
• selection: kanamycin
• 輸送温度: dry ice
• 保管温度: −20°C

詳細

詳細

CRISPR Cas9-D10A Nickase発現プラスミドには、Cas9の強力な一過性発現のためにCMVプロモーターを用いています。MluIとNheIを用いてCMVを別のプロモーターに置換することが可能です。また、T7によるmRNA産生のため、XbaIを用いてCas9-D10A発現プラスミドを直線化することが可能です。

アプリケーション

機能ゲノミクス／標的バリデーション

• 複数の細胞株における遺伝子ノックアウトの作成
• RNAiに適さない遺伝子の完全なノックアウト
• プロモーター、融合タグ、またはレポーターを内在性遺伝子に組み込んだノックイン細胞株の作製

特徴および利点

Cas9-D10Aベクターは、どのU6-guideRNAプラスミドとも組み合わせて用いることができます。Cas9とguideRNAの量を変えてCas9/gRNA比を最適化することができます。最近のエビデンスで、CRISPRエンドヌクレアーゼによるオフターゲット効果が重大な問題であることが示唆されました。この問題に対処するため、シグマはCRISPRのDNA認識鎖長をZFNやTALENと同程度に延長するため、ニッカーゼペアを用いる技術を開発しました。弊社の経験によると、Cas9-D10A変異体ではニッカーゼペアを用いて最も信頼性の高い結果が得られました。開発中、有効なニッカーゼペアの生成に欠かせない要素は5′末端間のgRNAの位置であることもわかりました。プラスミドによるCRISPRニッカーゼペアの送達には、Cas9-D10A発現ベクターと2種類のU6-gRNAベクターによる3プラスミドシステムを用いることを推奨します。ニッカーゼペアを簡単にご利用いただけるよう、シグマはプレデザインニッカーゼペアのライブラリーにアクセスできるオンラインツールを用意しています。シグマのオンラインCRISPR製品カタログで最新のデザインセットをご確認ください。

構成

1バイアルあたり1 μgのCas9-D10Aニッカーゼプラスミドを含みます。

製品にはガイドRNAは含まれないことにご留意ください。こちらは、Custom CRISPR製品タブから別個に購入していただく必要があります。

原理

CRISPR/Casシステムは、細菌や古細菌が有するウイルスやプラスミドの侵入に対する防御機構です。近年、細菌Streptococcus pyogenes由来のII型CRISPR/Casシステムが、単一のCas9タンパク質と非コーディングガイドRNA（gRNA）の2つの分子成分を用いて真核生物系で機能するように設計されました。Cas9エンドヌクレアーゼは、gRNAでプログラムすることができ、目的のゲノム位置でDNA二本鎖切断（DSB）を誘導します。Znフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）によって誘導されるDSBと同様に、細胞は内因性DNA修復プロセス（非相同末端結合（NHEJ）または相同性指向修復（HDR））を活性化して、標的とされたDSBを修復します。

物理的形状

シグマのCas9-D10A NickaseプラスミドDNAは、50μL中20 ng/μLの濃度で提供されます。

調製ノート

シグマのCRISPRプラスミド製品はミニプレップアリコートとして提供され、特定の細胞へのトランスフェクションには適していない可能性があります。最良の結果を得るため、トランスフェクションの前にエンドトキシンフリーDNA精製キットを用いてプラスミドをマキシプレップすることをお勧めします。

その他情報

DNAの二本鎖切断を媒介するには、2つのU6-gRNAプラスミドを併用する必要があります。

文献で報告されている一般的なトランスフェクション濃度は、Cas9プラスミドが1.0 μg/μL以上 5 μL以下、U6-gRNAプラスミドが1.0 μg/μL以上、5 μL以下の範囲です。（上記の用量は50〜100万個の細胞をヌクレオフェクションすると仮定しています）

法的情報

CRISPR使用許諾契約

安全性情報

• 保管分類コード: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• 引火点(°F): Not applicable
• 引火点(℃): Not applicable