Small Molecule HPLC

저분자 HPLC

저분자의 HPLC 분석은 주로 역상 분리 모드에서 수행됩니다. 극성 화합물을 분리하는 경우 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)와 순상(normal-phase) 크로마토그래피도 적합하며, HILIC가 선호되는 방법입니다. 이온 화합물을 분리하는 경우 이온 교환 분리 모드가 사용되고, 무기 음이온이나 양이온의 경우 이온 크로마토그래피도 사용될 수 있습니다.

HPLC 컬럼은 고정상으로 완전한 다공성 실리카 입자, 표면 다공성 실리카 입자, 중합체 입자 또는 단량체 실리카로 충전됩니다. 또한 산화 알루미늄, 지르코니아 입자, 탄소 입자가 사용됩니다. 저분자를 분리하기 위한 고정상 재료의 일반적인 공극 크기는 60 Å ~ 160 Å입니다. HPLC의 경우 고정상의 일반적인 입자 크기는 3 µm ~ 5 µm이며, UHPLC의 경우 더 작은 입자 크기인 2 µm 이하가 일반적으로 사용됩니다. 고정상에 다른 컬럼 선택도(변경)가 부착될 수 있습니다. C18 알킬 사슬은 역상(RP) 크로마토그래피에서 가장 일반적으로 사용되는 컬럼의 화학 물질입니다. 그럼에도 불구하고 C30, C8, 페닐, 펜타플루로페닐과 같은 기타 변경, 보다 광범위한 극성 변경, 이온 교환 또는 키랄 특성을 갖는 변경은 액체에 용해되는 거의 모든 화합물을 분리할 수 있습니다. RP-HPLC 이동상은 일반적으로 수용성 버퍼 또는 물과 아세토니트릴 또는 메탄올과 같은 수혼화성(water-miscible) 유기 용매로 구성됩니다.

HPLC 시료 전처리

식품, 음료, 화장품, 생물학적 시료, 매트릭스가 풍부한 제약품 제제(예: 크림, 시럽)와 같이 복잡하고 매트릭스가 풍부한 시료에서 원하지 않는 성분을 제거하고 관심 있는 분석물을 선택적으로 추출하기 위해 효율적인 시료 전처리 프로토콜이 필요합니다. 이는 2 µm 이하의 입자가 사용되는 UHPLC와 같이 입자 크기가 매우 작은 고정상인 경우 중요합니다. 일반적인 시료 전처리 방법은 액체-액체 추출, 고체상 추출(SPE)이며 생물학적 시료의 경우 여과 외에 단백질 침전도 있습니다. 표적 화합물의 선택적 용출 및 사전 농축 이외에도, 시료 전처리의 주요 목적은 시료 매트릭스에 의해 HPLC 고정상이 막히지 않도록 보호하는 것입니다. 단량체 실리카를 기반으로 하는 HPLC 컬럼은 매트리스를 높은 범위까지 허용할 수 있고, 미립자 컬럼보다 더 적은 시료 전처리가 필요합니다. 

유도체화

일부 분자의 경우 HPLC 분리 이전(사전 컬럼) 또는 이후(사후 컬럼)에 유도체화가 필요합니다. 유도체화는 HPLC에서 더 나은 민감도 또는 크로마토그래피 보유를 위해 분자를 이들의 유도체로 변환시킵니다. 필요한 유도체화를 위해 적절한 물리적 및 화학적 특성을 지닌 화학 시약을 사용합니다.